Digestione enzematica del DNA

Laurea liv.I

Facoltà: Scienze Matematiche, Fisiche e Naturali

Autore: Elisa Gaggioli Contatta »

Composta da 87 pagine.

 

Questa tesi ha raggiunto 277 click dal 18/02/2011.

Disponibile in PDF, la consultazione è esclusivamente in formato digitale.

 

 

Per approfondire questo argomento:

Questo articolo è estratto dal documento:

Creazione di PTK_GFP/LUC, vettore di trasfezione per la manipolazione genetica di Plasmodium berghei e per lo studio della risposta immunitaria murina. di Elisa Gaggioli

Le reazioni di digestione utilizzano particolari endonucleasi chiamate enzimi di restrizione.
Queste tagliano il DNA a livello di particolari sequenze consenso, generalmente palindromiche e lunghe dai 4 agli 8 nucleotidi, generando frammenti di DNA a doppia elica. L'attività di tali enzimi può generare due tipi di estremità a seconda che il taglio venga effettuato in maniera sfalsata o netta. Nel primo caso si ottengono estremità sporgenti o sticky ends come quelle generate da EcoRI, BamHI e NotI (Roche), nel secondo, estremità piatte o blunt ends. La sporgenza delle sticky ends può interessare l'estremità 5' e quella 3'.
La quantità di enzima da utilizzare dipende dalla quantità di DNA che si vuole digerire. Generalmente si utilizza 1U di enzima ogni μg di DNA11, ma nella pratica si lavora con un eccesso di enzima che può arrivare fino a 10 volte il rapporto consigliato e che permette di aumentare la resa della reazione. Infatti, quando il DNA di interesse è superavvolto, come nel caso di DNA plasmidico o genomico, all'inizio della digestione i siti di restrizione si trovano per la maggior parte nascosti e solo in seguito ai primi tagli, quando la struttura si rilassa, diventano completamente disponibili. Il volume di enzima non deve superare il 10% del volume finale della digestione: gli enzimi vengono conservati a -20°C, sospesi in una soluzione di glicerolo che ne impedisce il congelamento (crio-protettore), ma che, se presente in eccesso, può inibire la reazione stessa.