Cromatografia per gel filtrazione

Nella cromatografia per gel filtrazione, detta anche cromatografia ad esclusione molecolare oppure a setaccio molecolare, le molecole vengono separate in base alle loro dimensioni ed alla loro forma. In questa tecnica la fase stazionaria è costituita da sferette di materiale idrato, simile ad una spugna, contente pori che possono essere attraversati soltanto da molecole con certe dimensioni. In questo modo, le molecole con dimensioni troppo grandi saranno escluse dal volume di solvente presente all'interno dei pori. Queste molecole grandi attraverseranno di conseguenza molto rapidamente la colonna, cioè usciranno con un volume di eluzione minore di quello delle molecole che invece entrano nei pori. I materiali più comunemente usati per le cromatografie per gel di filtrazione sono il destrano (un polimero del glucosio ad alto peso molecolare), l'agarosio e la poliacrilamide. Comunque la gel filtrazione viene spesso usata per rimuovere i sali (desalare) da una soluzione proteica. Per esempio, le proteine precipitate con ammonio solfato possono essere facilmente deprivate di questo sale se il precipitato viene disciolto in un volume minimo di un opportuno tampone e se poi la soluzione viene posta su una colonna di gel con un limite di esclusione più basso della massa molecolare della proteina nel campione. Facendo passare il tampone attraverso la colonna, la proteina verrà eluita prima dell'ammonio solfato. Un'altra tecnica che separa le molecole in base alle loro dimensioni mediante l'uso di membrane semipermeabili contenenti pori è la dialisi. Questi pori consentono alle piccole molecole come quelle del solvente, dei sali e di piccoli metaboliti di attraversare la membrana, ma bloccano il passaggio di molecole più grandi. Il cellophane (acetato di cellulosa) è il materiale da dialisi più comunemente usato, ma possono essere utilizzati anche altri prodotti come la nitrocellulosa ed il collodio. La dialisi (che non può essere considerata una forma di cromatografia) viene usata di solito per cambiare il solvente in cui sono disciolte le macromolecole. Una soluzione di macromolecole viene racchiusa in un sacchetto da dialisi che viene poi immerso in un volume relativamente grande del nuovo solvente. Dopo alcune ore di rimescolamento le due soluzioni si sono equilibrate, ma le macromolecole sono rimaste all'interno del sacchetto da dialisi. Il processo può essere ripetuto diverse volte in modo da sostituire completamente un sistema di solventi con un altro.