Gel elettroforesi

La gel elettroforesi è tra i metodi più efficaci e convenienti usati per la separazione di macromolecole. I gel di uso più comune, la poliacrilamide e l'agarosio, hanno pori di dimensioni molecolari il cui diametro può essere scelto a priori. Le separazioni in questi casi si basano quindi sulla gel filtrazione oltre che sulla mobilità elettroforetica delle molecole. I gel in questi tipi di elettroforesi ritardano le molecole di grandi dimensioni rispetto a quelle piccole, l'inverso di quanto avviene nella gel filtrazione, in quanto non c'è spazio con solvente tra i granuli del gel per elettroforesi (che invece esiste tra le sferette del gel nella gel filtrazione). Quindi, mentre le molecole migrano attraverso il gel, il movimento delle molecole più grandi viene rallentato o impedito, separandole da quelle più piccole. Nell'elettroforesi su gel di poliacrilamide (PAGE), un tubo lungo da 3 a 10 cm, in cui è stato fatto polimerizzare il gel, viene sospeso verticalmente tra un recipiente superiore ed uno inferiore contenenti il tampone. Quest'ultimo, che è lo stesso nei recipienti e nel gel, ha di solito un pH (per le proteine circa 9) tale da conferire alle macromolecole una carica negativa e quindi da indurre una migrazione verso l'anodo (+) posto nel recipiente inferiore. Invece, per i gel in lastre (slab gel) i campioni vengono depositati in appositi pozzetti preparati in precedenza sulla sommità del gel. In alternativa, il campione può essere contenuto in una piccola frazione di gel, il gel del campione, i cui pori sono sufficientemente grandi da non impedire il movimento alle macromolecole di qualsiasi dimensione. Viene poi applicata una corrente continua di 300 V per il tempo necessario a separare i componenti macromolecolari in una serie di bande discrete. Queste bande possono essere meglio risolte e diventare più nette con una tecnica nota come elettroforesi a pH discontinuo oppure a disco, che richiede due sistemi di gel e diverse soluzioni tampone. Come sappiamo, quando viene applicata corrente, gli ioni migrano dal tampone nel recipiente superiore nel gel di accumulo e gli ioni presenti nel tampone di questo gel migrano anch'essi davanti a loro. Quando ha luogo questo spostamento, gli ioni del tampone nel recipiente superiore incontrano un pH che è molto più basso del valore della loro pK ed assumono quindi la loro forma scarica (nel caso della glicina la forma zwitteronica) e diventano elettroforeticamente immobili. Tutto ciò determina un aumento localizzato del campo elettrico per questo gli anioni macromolecolari migrano rapidamente fino a che non incontrano gli ioni del tampone del gel di accumulo, dove la loro migrazione tende a rallentare poiché in questa regione non vi è carenza di ioni. Questo effetto fa sì che le macromolecole ioniche si avvicinino al gel per la corsa e si accumulino in bande o dischi molto vicini tra loro, ordinati secondo la loro mobilità. Infine queste bande possono essere evidenziate con vari metodi come diversi coloranti.