Selezione delle origini e attivazione operata dell'iniziatore

Le proteine iniziatore svolgono la loro funzione durante la fase di inizio della replicazione. In primo luogo, queste proteine legano specifiche sequenze di DNA all'interno del replicatore; secondo, una volta legate al DNA, esse deformano o aprono la doppia elica in una regione del DNA adiacente al loro sito di legame; terzo, queste proteine interagiscono con fattori addizionali richiesti per l'inizio della replicazione. Per esempio in E. coli, la proteina DnaA, lega gli elementi di 9 bp ripetuti presenti in oriC, e la sua funzione viene regolata dalla presenza di ATP. Nelle cellule eucariotiche, invece, l'iniziatore è una proteina complessa esamerica chiamata ORC, origin recognition complex. La funzione di ORC è stata ben studiata nelle cellule di lievito, dove si è visto che riconosce una sequenza chiamata elemento-A e successivamente, tramite sempre idrolisi dell'ATP, riesce a richiamate tutto il macchinario necessario per la replicazione. Una volta che l'iniziatore si è legato al replicatore, gli altri processi coinvolti nell'inizio della replicazione sono largamente guidati da interazioni proteina-proteina e proteina-DNA, eventi che sono sequenza indipendenti. Infatti, dopo che l'iniziatore (DnaA) si è legato a oriC ed ha separato la doppia elica, la combinazione di DNA a singolo filamento con la proteina DnaA richiama un complesso formato da due fattori: la DNA elicasi (DnaB), ed il posizionatore della elicasi (DnaC). La DNA elicasi è mantenuta, inizialmente, in uno stato inattivo per poi attivarsi quando viene rilasciato il suo posizionatore e procede scorrendo in direzione 5'→3'. Le interazioni proteina-proteina fra la elicasi e gli altri componenti della forca replicativa, permettono l'assemblaggio del resto del complesso replicativo. La elicasi, infatti, richiama la DNA primasi verso l'origine di replicazione: ciò permette la sintesi di un RNA primer su ciascun filamento stampo. La DNA pol III oloenzima è reclutata all'origine mediante interazioni con la giunzione innesco:stampo e la elicasi. Una volta che l'oloenzima si è posizionato le sliding clamp sono assemblate sul primer e le DNA polimerasi che sintetizzano le catene leading iniziano a lavorare. Man mano che, per opera della elicasi, si crea del nuovo singolo filamento, esso viene ricoperto dalle SSB e la DNA primasi può sintetizzare sul filamento lagging, il primo primer.
L'inizio della replicazione negli eucarioti, invece, richiede due eventi che devono avvenire in tempi prestabiliti durante il ciclo cellulare: la selezione del replicatore e l'attivazione dell'origine. La selezione del replicatore è il processo che permette di identificare le sequenze che dirigeranno l'inizio della replicazione ed avviene nella fase G1 (e precede la fase S, dove deve avvenire la replicazione). Questo processo porta all'assemblaggio di un complesso multiproteico su ciascun replicatore del genoma. (Di solito i replicatori risultano essere metilati). L'attivazione dell'origine avviene solamente dopo che le cellule sono entrate in fase S e quando il complesso proteico associato al replicatore inizia a separare i due filamenti di DNA, e ad avviare il reclutamento della DNA polimerasi. La selezione del replicatore è mediata dalla formazione di un complesso pre-replicativo (pre-RC). Quest'ultimo è formato da quattro proteine separate che si assemblano su ciascun replicatore. Il primo stadio nella formazione del pre-RC è il riconoscimento del replicatore da parte dell'iniziatore ORC. Una volta che avviene questo si legano due posizionatori delle elicasi (Cdc6 e Cdt1). Questo complesso recluta infine l'elicasi. Il pre-RC viene definitivamente attivato da due proteine chinasi (Cdk e Ddk) nella fase S. Queste proteine fosforilano pre-RC e permettono l'avvio della replicazione e quindi il reclutamento di tutte le DNA polimerasi. Le proteine chinasi sono molto importanti in quanto controllano l'attività di migliaia di origini di replicazione per far si che vengano attivate una sola volta in ciascun ciclo. Infatti, si è visto, che Cdk gioca un doppio ruolo, grazie alla presenza di diverse concentrazioni nelle varie fasi del ciclo cellulare: da una parte attiva il pre-RC fosforilandolo, dall'altra inibisce la formazione dei nuovi pre-RC.