La manipolazione dei genomi virali

L'analisi fenotipica delle popolazioni virali è stata per molto tempo una tecnica standard in virologia. Lo studio delle varianti virali e di mutanti spontanei esistenti in natura è stato a lungo utilizzato per assegnare particolari funzioni ai vari geni virali. Tuttavia la biologia molecolare ha arricchito questo tipo di studi con la possibilità di progettare e creare mutazioni specifiche, delezioni e ricombinanti in vitro, rivelandosi uno strumento molto potente. La relativa semplicità dei genomi virali offre la possibilità di recuperare virus infettivi a partire da acidi nucleici clonati purificati. L'”infezione” di cellule con acidi nucleici nudi va sotto il nome di trasfezione. Il genoma dei virus a RNA con polarità (+) è infettivo quando introdotto come RNA purificato (vRNA) all'interno di una cellula in assenza di altre proteine virali. Questo perché, nel caso specifico, il vRNA a polarità (+) è essenzialmente come un mRNA, e il primo evento in una cellula normalmente infettata da questa classe di virus è la traduzione del vRNA nelle proteine virali che saranno coinvolte nella replicazione del genoma. Anche i genomi virali costituiti da DNA a doppio filamento sono infettivi. In questo caso il succedersi degli eventi è un po' più complesso; il genoma virale, infatti, deve essere prima trascritto dalla polimerasi dell'ospite per produrre mRNA. Inoltre, la maggior parte del DNA introdotto in una cellula mediante la trasfezione è degradata ad opera delle nucleasi cellulari; tuttavia, indipendentemente dalla sequenza, una piccola quantità riesce a raggiungere il nucleo dove viene trascritto dalle polimerasi dell'ospite. Anche il cDNA clonato dei genomi dei virus a RNA con polarità (+) (come i picornavirus) è infettivo, sebbene sia meno efficiente rispetto al vRNA. Tale osservazione si può spiegare con il fatto che il DNA deve essere trascritto in RNA dagli enzimi cellulari; mentre l'RNA trascritto in vitro a partire dal cDNA stampo del genoma è direttamente tradotto. Utilizzando queste tecniche, possono essere recuperate particelle virali da genomi clonati, compresi quelli manipolati in vitro. Fino a poco tempo fa non era possibile utilizzare questo tipo di approccio per studiare i virus provvisti di genoma a polarità (-), poiché tutte le particelle virali dei virus appartenenti a questa classe contengono una polimerasi virus-specifica. Per questi virus, una volta che il genoma è entrato nella cellula, la prima tappa è quella di copiare, ad opera della polimerasi virus-specifica, il genoma a polarità (-) o in trascritti (+) che sono utilizzati direttamente come mRNA, o in una molecola a doppio filamento, nota come intermedio di replicazione (RI) o forma replicativa (RF), che servirà da stampo per altri cicli di sintesi di mRNA. Quindi, poiché i genomi purificati con polarità (-) non possono essere tradotti direttamente e non possono essere replicati in assenza della polimerasi virale, essi sono intrinsecamente non infettivi. Recentemente sono stati sviluppati dei sistemi che permettono di ottenere anche virus con genoma a polarità (-) ad acidi nucleici purificati o clonati. Questi approcci vanno generalmente sotto il nome di “genetica inversa”, cioè la manipolazione di genomi a RNA a polarità (-) attraverso un intermedio a DNA. Tutti questi sistemi si avvalgono della formazione di un complesso ribonucleoproteico che può essere utilizzato come stampo per la replicazione del genoma da parte dell'RNA polimerasi RNA-dipendente.