Le colture cellulari

Generalmente i protocolli di isolamento prevedono una prima fase il cui scopo è quello di separare i diversi tipi cellulari presenti nel tessuto demolendo la matrice extracellulare e le giunzioni intercellulari che le mantengono unite. 

A tale scopo il tessuto viene incubato con enzimi proteolitici (tripsina e/o collagenasi) dissociando le singole cellule mediante tecniche meccaniche. Alla fase di dissociazione segue la fase di separazione; per separare i vari tipi cellulari da una sospensione cellulare mista si può procedere in vari modi:

1. Separando le cellule in base alle loro dimensioni o al loro peso, centrifugandole a bassa velocità con l’ausilio di sostanze (es Percoll, Ficoll o Lymphoprep) che possono anche essere stratificate in gradienti a diversa densità;
2. Sfruttando la diversa attitudine dei diversi tipi cellulari ad aderire su superfici di vetro o di plastica;
3. Marcando le cellule con anticorpi coniugati con sostanze fluorescenti, e poi separando le cellule marcate da quelle non marcate;
4. Utilizzando terreni di coltura selettivi che favoriscano la crescita solo di alcuni tipi cellulari e/o aggiungendo al terreno di coltura ormoni che favoriscono (o inibiscono) la crescita di determinati tipi cellulari.

La sospensione cellulare omogenea così ottenuta è messa in “coltura”, cioè viene trasferita in contenitori appositi contenenti miscele di sostanze inorganiche ed organiche necessarie al sostentamento delle cellule. Le cellule crescono adese o in sospensione. Le cellule che crescono al supporto su cui sono state seminate (cioè sulla parete della fiasca) crescono formando monostrati (se sono sane, in quanto risentono dell’inibizione da contatto) o pluristrati (se sono tumorali e quindi non risentono dell’inibizione da contatto e formano i cosiddetti foci di trasformazione, singolare focus). Le cellule non crescono adese alla parete della fiasca, ma sospese nel terreno di coltura senza aderire ad alcun supporto. 

Esistono differenti tipi di colture cellulari: coltura primaria, coltura preparata a partire dai tessuti di un organismo eucariote vuol dire prendere da un animale dei pezzetti di tessuto specifico, disgregare questo tessuto tramite uso di proteasi e collagenasi, recuperare le singole cellule che formano questo tessuto e metterle in coltura. 

Queste colture primarie hanno vita breve e vivono per pochi cicli di replicazione, massimo 5-10 replicazioni per cellula; coltura secondaria, coltura propagata a partire dalle colture primarie, cellule di linea o immortalizzate, gruppi di cellule morfologicamente uniformi che possono essere propagate in vitro per un tempo indefinito, clone, popolazione proveniente da un’unica cellula progenitrice. 

Le colture possono essere inoltre suddivise in coltura finita, quando alcuni tipi di cellule normali (fibroblasti o linfociti) possono essere coltivati in vitro, in presenza di un'alta percentuale di siero, per un periodo di tempo limitato e per un numero totale di divisioni cellulari limitato (50-100) fino a quando raggiungono una fase di crisi in seguito alla quale cessando di dividersi ed entrano in una fase di senescenza che conduce alla morte cellulare, o coltura continua, deriva da colture di cellule primarie che, per acquisizioni di mutazioni geniche (linea cellulare immortalizzata non trasformata) o in seguito a trasformazioni in vivo (es. tumori) o in vitro (es. per infezione con virus EBV) (linea cellulare trasformata), hanno superato la fase di crisi e sono in grado di crescere infinitamente. I materiali e le sostante utilizzate per le colture sono:
MEM (Minimum Essential Medium): è il terreno di coltura;
FBS (Siero Fetale Bovino): contiene numerosi fattori di crescita (non contenuti nel terreno di coltura) utili per la crescita delle cellule.
TRIPSINA: enzima proteolitico che rompe i legami peptidici delle proteine extracellulari che costituiscono il substrato su cui le cellule sono ancorate (nel nostro caso serve per staccare le cellule dalla plastica della fiasca): la temperatura ottimale per il suo funzionamento è 37°C ma funziona anche a temperatura ambiente. In questo caso occorre lasciar agire per un tempo più lungo.
FIASCHE: sono i “contenitori” in cui le cellule proliferano. Internamente sono sterili; possono avere un tappo ventilato, cioè con un filtro che permette gli scambi gassosi e contemporaneamente garantisce la sterilità della coltura.
TUBI: sono provette a fondo conico con capienza di 15 e 50 ml utilizzate per riporre i reagenti liquidi e per la centrifugazione delle sospensioni cellulari.
Il terreno di coltura, invece, viene scelto in base alle caratteristiche e alle esigenze del tipo cellulare utilizzato. Può essere liquido (pronto all’uso) oppure in polvere (in tal caso deve essere ricostituito come indicato dalla casa produttrice). In ogni caso il terreno di coltura deve avere le seguenti caratteristiche: 1) deve avere determinati valori di pH e osmolarità; 2) deve essere non tossico; 3) deve contenere tutti i composti necessari al metabolismo cellulare, e precisamente: ioni, per mantenere il bilancio osmotico; zuccheri, come fonte di energia; amminoacidi, per la formazione di proteine; vitamine, cofattori enzimatici. 

Prima dell’uso al terreno di coltura vengono aggiunti una miscela di antibiotici (di solito penicillina/streptomicina) e un antimicotico (generalmente anfotericina B). Un problema che ha reso difficili i tentativi pionieristici di mantenimento di colture e complica la vita quotidiana dei biologi cellulari è la sterilità: i terreni di coltura ed il siero sono infatti molto "appetibili" per batteri, lieviti e funghi che possono facilmente inquinare le colture cellulari. 

Questo problema viene affrontato a vari livelli:
1)Tutte le manipolazioni delle colture cellulari vengono fatte in cappe a flusso laminare provviste di filtri, che limitano la contaminazione occasionale con microrganismi trasportati dall'aria.
2)Tutti i materiali utilizzati per la manipolazione (pipette, piastre da coltura) sono sterili e di norma monouso.
3)Ai terreni di coltura vengono spesso aggiunti antibiotici per limitare la possibilità di inquinamento da parte dei più comuni batteri.
I sistemi di sterilizzazione che servono appunto per ovviare a questi problemi sono tutt'oggi:
Filtri : si utilizzano per sterilizzare i terreni, i tamponi o altre sostanza allo stato liquido. Si tratta di membrane di cellulosa o altre sostanze (nylon, nitrocellulosa, polisulfone, policarbonato; la scelta del tipo di filtro dipende dalla sostanza che dobbiamo filtrare) che differiscono per la porosità (di solito usiamo membrane con pori da 0,2 m che ci permettono di filtrare i possibili contaminanti presenti nella soluzione) e per il diametro (dipende dall’uso che ne vogliamo fare, ad esempio se vogliamo applicarlo ad una siringa o ad un apparato di filtrazione). Durante l’uso è consigliabile non applicare una pressione troppo alta che provocherebbe una rottura del filtro.
Mezzi chimici: si usano sostanze dal conosciuto potere germicida, diluite alle concentrazioni opportune. Le sostanze più usate sono l’ipoclorito di sodio (concentrazione [c] d’uso 2%), lo Zefirol ([c] d’uso dall’1% al 5%) e l’etanolo ([c] d’uso 70%). Si utilizzano per la pulizia degli strumenti, della cappa, dell’incubatore, delle mani dell’operatore e di tutto ciò che non può essere sterilizzato con altri mezzi.
Mezzi fisici : sono due, i raggi ultravioletti ed il calore. L’uso dei raggi ultravioletti è possibile grazie all’esistenza di particolari lampade (lampade UV) che vengono accese nella cappa sterile e/o nell’ambiente in cui è posta la cappa. Tali lampade vanno tenute accese minimo due ore, preferibilmente tutta la notte. 

La sterilizzazione con il calore è utilizzata per la vetreria e per strumenti di metallo e plastica; si distingue sterilizzazione a secco (in stufe che raggiungono dai 180°C ai 300°C) per la strumentazione in vetro che non ha pezzi di plastica (che non resisterebbero a tali temperature) e sterilizzazione in autoclave (che sterilizza con vapore acqueo a 120°C) dove si possono mettere a sterilizzare strumenti di plastica o bottiglie (compreso il tappo).
I vantaggi derivati dall'uso delle colture cellulari sono:
Le colture costituiscono un materiale abbondante ed omogeneo per lo studio delle cellule sia in condizioni fisiologiche che in seguito al trattamento con agenti chimici, fisici e biologici.
Si possono ottenere cloni e varianti della cellula originale.
Si possono congelare e recuperare a distanza di anni.
Si possono testare contemporaneamente anche un gran numero di condizioni sperimentali con risparmio di tempo (il tempo necessario per osservare una modificazione in vivo è molto più lungo di quello necessario per vedere una modificazione in vitro ).
L’uso delle colture permette di evitare la vivisezione ed il sacrificio di animali.
La coltura cellulare è un sistema più economico rispetto al mantenimento di animali.
L’uso delle colture permette di ottenere dati riproducibili.
Gli svantaggi invece risultano essere:
L’uso delle colture fornisce una visione un po’ “ristretta” della realtà, in quanto non è possibile tener conto di tutte le variabili che intervengono in vivo , e nemmeno riprodurle in vitro.
Su alcune linee cellulari non possono essere effettuati alcuni tipi di studi (ad esempio studi sull’inibizione da contatto non possono essere effettuati sulle cellule tumorali).
Pericolo di contaminazioni.
Esperienza degli operatori.
Il protocollo standard per la crescita di una coltura cellulare può essere schematizzato: Da una fiasca contenente cellule a confluenza: Scartare il terreno di coltura; Lavare con MEM senza siero; Aggiungere tripsina; Lasciar agire la tripsina per circa 5 min a 37°C; In questo tempo preparare un tubo contenente MEM + FCS al 10%; Trascorsi i 5 minuti, verificare che le cellule si siano staccate; quindi aggiungere il MEM + FCS al 10% e centrifugare (10 min a 500xg); Scartare il sopranatante (sul fondo del tubo è visibile il pellet, composto dalle cellule sedimentate); Aggiungere al sedimento una piccola quantità (circa 1 ml) di MEM + FCS al 10% per effettuare una risospensione graduale delle cellule; aggiungere altro MEM + FCS al 10% fino a raggiungere il volume desiderato. Prelevare un certo volume di sospensione cellulare e seminare in fiasca; il volume di sospensione cellulare da seminare dipende dalla superficie di crescita della fiasca e dalla densità desiderata (nel nostro caso seminiamo 2 ml di sospensione cellulare in una fiasca che ha superficie di crescita di 25cm2, contenente 10 ml di MEM + FCS al 10%). (Come sappiamo la capacità delle cellule di crescersi e dividersi è controllata da un orologio cellulare. Quest'ultimo è composto da proteine che integrano i segnali pro- e anti- proliferanti provenienti dall'ambiente esterno e dall'interno della cellula. Abbiano dei regolatori positivi che attivano il ciclo cellulare e invece dei regolatori negativi che lo inibiscono. 

Nei primi abbiano i complessi ciclina-CDK che sono delle chinasi ciclina-dipendente che vanno a fosforilare il retinoblastoma, che liberano E2F per trascrivere dei geni necessari per G1 e S. Dei secondi invece fanno parte gli inibitori dei complessi ciclina-CDK e oncosopressori.)