Determinazione della struttura primaria delle proteina

Il procedimento per la determinazione della struttura primaria delle proteine, si basa sulle tecniche di chimica delle proteine sviluppate da Sanger. Il procedimento consiste in tre parti concettuali, ognuna delle quali può essere suddivisa in diverse fasi di lavoro:
1) Preparazione della proteina per la determinazione della sequenza.

• (a) Determinazione del numero di catene polipeptidiche/subunità diverse presenti nella proteina
• (b) Rottura dei ponti disolfuro;
• (c) Separazione e purificazione delle singole subunità;
• (d) Determinazione della composizione in amminoacidi di ciascuna subunità;

• (a) Frammentazione delle singole subunità in punti specifici per formare peptidi sufficientemente piccoli da essere sequenziati direttamente;
• (b) Separazione e purificazione dei frammenti;
• (c) Determinazione della sequenza di ogni frammento peptidico;
• (d) Ripetizione della tappa 2(a) con un processo di frammentazione con una specificità diversa, in modo che la catena polipeptidica venga rotta a livello di legami peptidici diversi da quelli che otteniamo con la prima frammentazione;

• (a) Sovrapposizione della sequenza ai punti di rottura di un gruppo di una serie di frammenti peptidici con la sequenza di quelli di un altro gruppo. Confrontando la sequenza di questi frammenti, è possibile porli nell'ordine corretto in cui sono nelle subunità e quindi stabilire la sequenza amminoacidica;
• (b) Determinazione delle posizioni dei ponti disolfuro, se vi sono, sia tra le subunità che nell'interno di ciascuna subunità.