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Gli apparati proteici per la ricombinazione omologa

Tutti gli organismi viventi codificano per degli enzimi che catalizzano i passaggi biochimici della ricombinazione. Per alcuni di questi passaggi i membri di famiglie di proteine omologhe adempiono alla stessa funzione in tutti gli essere viventi; per altri, nei diversi organismi intervengono distinte classi di proteine che, comunque, portano allo stesso prodotto finale. La maggior parte delle nostre conoscenze sul meccanismo della ricombinazione deriva dagli studi effettuati su E. coli ed il suo fago, in cui il principale sistema di riparazione delle rotture a doppio filamento (DSB) è noto come il sistema RecBCD. Come abbiamo visto, le molecole di DNA con delle estensioni o code a singolo filamento sono il substrato preferenziale per iniziare lo scambio dei filamenti tra regioni omologhe. L'enzima RecBCD è composto da tre subunità e possiede sia un'attività DNA elicasica che una nucleasica, tutte queste funzioni sono controllate da specifici elementi di sequenza noti come siti chi. Si lega alle molecole di DNA sulle rotture a doppio filamento e scorre lungo il DNA usando l'energia dell'idrolisi dell'ATP. Come risultato della sua attività il DNA è svolto. In dettaglio, RecBCD entra sul DNA a livello della rottura a doppio filamento e si muove lungo il DNA, svolgendo le eliche. Le subunità RecB e RecD sono entrambi due DNA elicasi, ovvero, degli enzimi che usano l'idrolisi dell'ATP per fondere gli appaiamenti tra le basi. Spesso, mentre svolge il DNA, l'attività nucleasica di RecBCD taglia entrambi i filamenti, distruggendo la doppia elica. Quando incontra la sequenza chi, l'attività nucleasica viene modificata. Infatti, RecBCD non idrolizza più il DNA con polarità 3'→5' mentre viene digerito più velocemente l'altro filamento di DNA, quello con polarità 5'→3'. Come risultato di questo cambiamento di attività, una molecola di DNA a doppio filamento viene trasformata in una con una coda al 3' a singolo filamento, terminante con la sequenza chi. Questa struttura è ideale per l'associazione immediata di RecA. Infatti, l'interazione diretta di RecBCD con RecA promuove l'assemblaggio di quest'ultima sull'estremità a singolo filamento assicurandone il legame al posto delle SSB (le proteine che legano il DNA a singolo filamento). Comunque, i siti chi aumentano la frequenza di ricombinazione di circa dieci volte e questo aumento è più pronunciato proprio nelle regioni adiacenti al sito mentre diminuisce gradualmente con la distanza. Inoltre, la capacità dei siti chi di regolare l'attività nucleasica di RecBCD aiuta anche le cellule batteriche a proteggersi dal DNA estraneo, che può entrare attraverso un infezione fagica o un evento di coniugazione. La sequenza chi di otto nucleotidi (GCTGGTGG) è altamente rappresentata nel genoma di E. coli, per questo se un DNA di E. coli entra nello stesso batterio verrà immediatamente processato da RecBCD, così da formare un estremità 3' a singolo filamento. Viceversa, il DNA di un'altra specie non avrà un'alta frequenza di siti chi e l'azione di RecBCD, su questo DNA, porterà ad un estesa degradazione, invece che all'attivazione per ricombinazione.
RecA è la proteina centrale delle ricombinazione omologa. È il membro fondatore di una famiglia di enzimi chiamati proteine che scambiano il filamento. Queste proteine catalizzano l'appaiamento tra le molecole di DNA omologhe; un'attività che implica sia la ricerca di sequenze equivalenti tra due molecole, che la formazione su di esse di regioni di appaiamento. La forma attiva di RecA è un filamento nucleoproteico enorme e di dimensioni variabili: sono piuttosto frequenti filamenti che contengono approssimativamente 100 subunità di RecA e 300 nucleotidi di DNA. In seguito al legame con RecA, la lunghezza di una molecola di DNA aumenta di circa 1,5 volte. Infatti, per formare un filamento, le subunità di RecA si legano in modo cooperativo al DNA. Il legame di RecA ed il suo assemblaggio avvengono molto più rapidamente su un DNA a singolo filamento che su di una doppia elica, a dimostrazione della necessità di regioni di DNA a singola elica come substrati per lo scambio dei filamenti. Questo complesso RecA-ssDNA è la forma attiva che partecipa alla ricerca della regione di omologia, nella quale RecA deve “cercare” una complementarietà tra le coppie di basi del DNA nel filamento e una nuova molecola di DNA. Questa ricerca di omologia è promossa da RecA perché la sua struttura nucleoproteica è caratterizzata da due distinti siti di legame al DNA: un sito primario (legato alla prima molecola di DNA) ed un sito secondario. Quest'ultimo può essere occupato da una molecola a doppio filamento, il cui legame è veloce, debole, transitorio e indipendente dalla sequenza. In questo modo il filamento RecA può legare enormi pezzi di DNA ed analizzare rapidamente se in essi siano presenti delle sequenze omologhe. Come fa il filamento RecA ad avvertire la presenza di omologia di sequenza è ancora un meccanismo non conosciuto ma si è visto che il DNA legato al sito secondario viene temporaneamente aperto e valutato per la complementarietà con il DNA a singolo filamento presente nel sito primario. Inoltre, un'identità di sequenza di solamente 15 paia di basi fornisce al filamento RecA il segnale che l'omologia è stata trovata, e, quindi si attiva lo scambio del filamento. A questo punto, RecA promuove la formazione di un complesso stabile tra queste due molecole di DNA. Questa struttura a tre filamenti, legata da RecA, è detta molecola giunta ed, in genere, contiene parecchie centinaia di paia di basi del DNA ibrido. Quindi, il filamento di DNA nel sito di legame primario si appaia con il suo complementare appartenente al duplex legato al sito secondario. Lo scambio del filamento richiede quindi la rottura di una serie di appaiamenti e la formazione di una nuova serie del tutto identica. Bisogna ricordare che proteine che effettuano lo scambio del filamento della stessa famiglia di RecA sono presenti in tutte le forme vivente. Tra queste le più caratterizzate sono Rad51 e Dmc1 negli eucarioti.
Una volta terminato il passaggio dell'invasione del filamento, le due molecole di DNA, coinvolte nella ricombinazione, sono unite da un punto di incrocio, noto come giunzione di Holliday. A questo punto, una proteina detta RuvA riconosce la struttura della giunzione a prescindere dalla sequenza e recluta la proteine RuvB, un'ATPasi esamerica simile alle elicasi coinvolte nella replicazione del DNA. Quest'ultima fornisce l'energia necessaria a scambiare gli appaiamenti tra le basi così da permettere il movimento del chiasma. I modelli strutturali dei complessi RuvAB sulla giunzione di Holliday mostrano come un tetramero di RuvA cooperi con due esameri di RuvB per rafforzare questo processo di scambio. Nell'ultima parte del processo di ricombinazione, ossia la risoluzione delle giunzione di Holliday, interviene, nei batteri, RuvC, un endonucleasi capace di tagliare le giunzioni di DNA formate da RecA interagendo con altre due proteine RuvA e RuvB. La risoluzione mediata da RuvC avviene quando quest'ultima riconosce la giunzione di Holliday ed incide specificatamente due dei filamenti di DNA omologo, con la stessa polarità. Questo taglio porta a delle molecole di DNA che terminano con i gruppi 5' P e 3' OH, che possono essere unite da una DNA ligasi. A seconda di quale coppia di filamenti sia stata tagliata da RuvC, i prodotti di ricombinazione, una volta uniti dalla ligasi, saranno del tipo “splice” (scambio) o del tipo “patch” (del non scambio). Comunque, nonostante RuvC riconosca una struttura, piuttosto che una specifica sequenza, essa taglia il DNA solamente dopo la seconda T dei siti caratterizzati dalla sequenza consenso 5'A/T-T-T-G/C. Nel DNA queste sequenze ricorrono una volta ogni 64 nucleotidi.
Tratto da BIOLOGIA MOLECOLARE di Domenico Azarnia Tehran
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