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Il macchinario dello spliceosoma e le vie dello splicing

Le reazioni di transesterificazione appena descritte sono mediate da un'enorme “macchina” molecolare chiamata spliceosoma. Questo complesso è costituito da circa 150 proteine e 5 RNA e ha dimensioni simili a quelle di un ribosoma. Gli RNA riconoscono le sequenze ai confini introne-esone e molto probabilmente partecipano essi stessi alla catalisi della reazione di splicing. I cinque RNA (U1, U2, U4, U5 e U6) sono nel loro insieme chiamati piccoli RNA nucleari (snRNA, small nuclear RNA). Ciascuno di questi RNA è lungo dai 100 ai 300 nucleotidi e si complessa con diverse proteine. Questi complessi RNA-proteine sono detti piccoli ribonucleoproteine nucleari (snRNP, small nuclear ribonuclear protein). Le snRNP rivestono tre ruoli nello splicing: riconoscono il sito di splicing 5' e il punto di ramificazione; portano questi siti vicini quando occorre e catalizzano il taglio e la giunzione dell'RNA. All'inizio del processo di splicing, il sito di splicing 5' viene riconosciuto dalla snRNP U1 (attraverso l'appaiamento delle basi del suo snRNA e del pre-mRNA). Una delle subunità di U2AF si lega al segmento polipirimidinico, mentre l'altra si lega al sito di splicing 3'. La prima subunità interagisce con BBP e aiuta questa proteina a legarsi al punto di ramificazione. A questo punto, la snRNP U2 si lega al punto di ramificazione, con l'aiuto di U2AF, e spiazza BBP. Questo arrangiamento è chiamato complessa A. L'appaiamento di basi tra l'snRNA U2 e il punto di ramificazione è tale che il residuo di A dal punto di ramificazione venga spinto fuori dal segmento risultante a doppia elica di RNA e formi una protuberanza a singolo nucleotide. Questa A diventa così non accoppiata e disponibile per la reazione con il sito di splicing 5'. Successivamente, le snRNP U4 e U6, assieme alla snRNP U5, si uniscono al complesso. Queste tre snRNP assieme sono dette tripla snRNP U4/U6*U5, in cui le snRNP U4 e U6 sono tenute assieme dall'accoppiamento complementare delle basi dei loro corrispettivi snRNA, mentre la snRNP U5 è legata in maniera più lassa attraverso interazioni proteina-proteina. Con l'ingresso della tripla snRNP il complesso A diventa complesso B. Nel passaggio successivo, U1 lascia il complesso e U6 lo rimpiazza al sito di splicing 5'. Il riarrangiamento successivo innesca la catalisi ed avviene nel modo seguente: U4 viene rilasciato dal complesso permettendo a U6 di interagire con U2. Questo riarrangiamento chiamato complesso C produce il sito attivo, permettendo all'RNA substrato di posizionarsi correttamente. Infatti, la formazione del sito attivo mette in prossimità il sito di splicing 5' del pre-mRNA e il punto di ramificazione, facilitando la prima reazione di transesterificazione. La seconda reazione, tra i siti splicing 5' e 3', è supportata dalla snRNP U5, che aiuta ad avvicinare i due esoni.

Finora abbiamo considerato solo lo splicing del pre-mRNA nucleare, mediato dallo spliceosoma, comune in tutti  gli eucarioti. Me vi sono anche gli introni self-splicing del gruppo I e gruppo II, introni in grado di autorimuoversi dagli RNA, in una provetta, in assenza di proteine o di altre molecole di RNA. Nel caso degli introni del gruppo II, la chimica dello splicing, quindi le due reazioni di transesterificazione, e gli intermedi di RNA prodotti sono gli stessi di quelli per i pre-mRNA nucleari. Gli introni del gruppo I, invece, subiscono uno splicing secondo un percorso diverso. Anziché un residuo di A nel punto di ramificazione, utilizzano un nucleotide o nucleoside G libero. Questa G è legata dall'RNA e il suo gruppo 3' OH viene presentato al sito di splicing 5'. Lo stesso tipo di transesterificazione che porta alla formazione del cappio negli esempi precedenti, qui unisce la G all'estremità 5' dell'introne. La seconda reazione ora procede come negli esempi precedenti: l'estremità 3' libera dell'esone attacca il sito di splicing 3'. Questo unisce i due esoni e rilascia l'introne, questa volta in forma libera invece che a cappio.
Un gene umano medio contiene otto o nove esoni e può essere tagliato in tre forme alternative, vi sono però altri geni di altri organismi, come ad esempio Drosophila, in cui abbiamo 38000 modi alternativi (ma anche nell'uomo vi sono geni contenenti 363 esoni). Inoltre l'esone medio è lungo solo 150 nucleotidi, mentre la lunghezza media degli introni è di circa 3000 nucleotidi, di conseguenza, gli esoni devono essere identificati all'interno di un oceano di sequenze introniche. Per questi e altri motivi, il riconoscimento del sito di splicing prevede due tipi di errori: 1) in primo luogo, il sito di splicing può essere saltato, ad esempio un dato sito di splicing 5' può appaiarsi con quelli al 3' al di là di quello corretto, o 2) in secondo luogo, altri siti con una sequenza simile a quella di splicing corretta possono essere riconosciuti erroneamente. Per questo motivo vi sono due modi con cui l'accuratezza della selezione di siti di splicing può essere mantenuta. Per primo, l'RNA polimerasi II, mentre trascrive, trasporta diverse proteine che sono coinvolte nello splicing. Quando si incontra un sito di splicing 5', lungo la molecola di RNA appena sintetizzata, queste proteine vengono trasferite dalla coda C-terminale della polimerasi sull'RNA stesso. Una volta posizionati, i componenti sul sito 5' aspettano di interagire con i componenti che si legano al sito di splicing 3' successivo, pronto per essere trascritto. In questo modo, il sito corretto di splicing 3' può essere riconosciuto prima che gli altri siti competitori a valle vengano trascritti. Il secondo meccanismo di protezione contro l'utilizzo di siti non corretti è il fatto che vengono riconosciuti preferenzialmente i siti di splicing vicini agli esoni (quindi quelli che sono probabilmente i più legittimi). Le proteine chiamate SR si legano alle sequenze collocate all'interno degli esoni dette enhancer di splicing esonico (exonic splicing enhancer, ESE). Le proteine SR, legate a questi siti, interagiscono con alcuni componenti del macchinario di splicing, reclutandoli nei siti di splicing vicini. In questo modo, il macchinario di splicing si lega in maniera più efficiente in questi siti di splicing rispetto a quando non faccia in quelli non corretti, lontano dagli esoni.
Tratto da BIOLOGIA MOLECOLARE di Domenico Azarnia Tehran
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