Metodi di saggio dei virus

Per quantificare delle particelle virali è possibile usare il microscopio elettronico e contare ogni singola particella oppure usare il saggio di emoagglutinazione è una titolazione, e si può usare solo con virus emoagglutinanti .Con microscopia a scansione vediamo globuli rossi con virus influenzali sulla loro superficie. Alcuni virus hanno la capacità di riconoscere attraverso proteine presenti sulla loro superficie, delle molecole presenti sui globuli rossi, in particolare l'acido sialico di cui i globuli rossi sono molto ricchi. Questi virioni, potendo interagire con gli eritrociti, agglutinano e quindi tengono vicino a se più eritrociti agglutinandoli. Possiamo quindi usare questa tecnica per titolare questi virus. In delle piastre con pozzetti ad U si distribuisce prima un tampone dello stesso volume, es. 100 microlitri; poi prendiamo 100 microlitri della nostra sospensione virale effettuando quindi una diluizione 1 a 2. Agitiamo per rendere omogenea la diluizione, e prendiamo 100 microlitri del primo pozzetto trasferendoli nel secondo pozzetto, così da fare una diluizione 1 a 4; così si continua facendo altre diluizioni di due. Dopo le diluizioni si aggiungono in tutti i pozzetti 100 microlitri di emazie allo 0,5% (emazie di pollo, di coniglio o umane di gruppo 0 RH negativo). A questo punto bisogna attendere che questi eritrociti sedimentino in base alla forza di gravità. Se il virus non c'è, gli eritrociti sedimentando andranno a sbattere contro le pareti del pozzetto a U, formando un bottoncino in fondo al pozzetto. Se il virus c'è, esso farà un reticolo di emazie che darà l'agglutinazione dei globuli rossi. Il pozzetto appare quindi in questo caso omogeneamente colorato in rosso e non si avrà solo un puntino in fondo. Questa è una tecnica macroscopica che in un'ora permette di titolare il virus, anche se può essere usata solo per i virus che causano agglutinazione delle emazie. Le diluizioni sono ravvicinate (in base due piuttosto che dieci) ma, affinché avvenga il fenomeno dell'agglutinazione, è stato calcolato che è necessaria la presenza di almeno 105 virioni. Lo scarto è quindi abbastanza grande, cosa che da poca precisione al metodo. Il titolo, in questo caso, viene dato in HU/ml ed è dato dall'inverso dell'ultima diluizione in cui si osserva l'agglutinazione. Un ulteriore uso della capacità dei virus di legare le emazie ci permette di vedere quali sono le emazie infette da questi virus. Molte delle glicoproteine virali, tra cui quelle che causano l'emoagglutinazione (la HA, emoagglutinina), prodotte durante il ciclo di replicazione virale vengono esposte sulla superficie della cellula infetta permettendo appunto questo fenomeno. L'agglutinazione ci permette di vedere anche come alcuni virus non hanno un grosso rilascio dalle cellule infette.