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Clonaggio del DNA

La capacità di costruire molecole di DNA ricombinante e di mantenerle nelle cellule viene detta clonaggio del DNA. Il processo coinvolge un vettore, che fornisce l'informazione per propagare il DNA clonato nella cellula, ed un inserto di DNA, che viene inserito nel vettore e contiene il DNA di interesse. 

Per costruire molecole di DNA ricombinante sono fondamentali gli enzimi di restrizione, che tagliano il DNA in siti specifici, ed altri enzimi che consentono di unire gli uni agli altri i frammenti di DNA tagliati. Però, una volta che il DNA è tagliato in frammenti dagli enzimi di restrizione deve essere inserito in un vettore per la propagazione. Cioè, il frammento di DNA deve essere inserito in una seconda molecola di DNA (il vettore) per essere replicato in un organismo ospite. 
I vettori per DNA hanno tre caratteristiche: 
  1. contengono un'origine di replicazione che permette loro di replicarsi indipendentemente dal cromosoma dell'ospite; 
  2. contengono un marcatore di selezione che permette alla cellula che contiene in vettore di essere facilmente identificate; e 
  3. possiedono singoli siti di taglio per enzimi di restrizione. Ciò consente di inserire i frammenti di DNA in posizioni definite all'interno di un vettore altrimenti intatto. 
I vettori più comuni, che soddisfano le prime due caratteristiche, sono piccole molecole di DNA circolare (circa 3 kb) dette plasmidi. Infatti, queste molecole, associate al cromosoma batterico hanno un'origine di replicazione e possiedono geni marcatori, come ad esempio quelli per la resistenza a particolari antibiotici. Inoltre, in alcuni casi, questi plasmidi possiedono siti unici di restrizione. Però, dopo la loro scoperta, i plasmidi sono stati semplificati e modificati in modo che un tipico vettore plasmidico ora possieda più di 20 siti unici di restrizione in una regione relativamente piccola. Ciò consente di utilizzare una varietà maggiore di enzimi di restrizione per tagliare il DNA bersaglio. Anche i virus e i fagi sono stati modificati in modo da poter essere usati come vettori di clonaggio. A questo punto, e con queste informazioni, supponiamo che un vettore plasmidico contenga un singolo sito di riconoscimento per EcoRI. Il plasmide digerito con l'enzima di restrizione sarà linearizzato. 
Dato che EcoRI genera estremità che protrudono al 5' e che sono complementari tra loro, le estremità sono in grado di riassociarsi e di dare origine ad una forma circolare del plasmide con due tagli. A questo punto il DNA bersaglio, che vogliamo clonare, viene digerito con lo stesso enzima di restrizione per far sì che abbia le estremità complementari al taglio del plasmide. In seguito, il trattamento del plasmide stesso con l'enzima DNA ligasi, in presenza di ATP, chiude i tagli, rigenerando un plasmide covalentemente chiuso, in cui però troviamo incorporato l'inserto di DNA da noi preso in considerazione. 
Per procedere con quest'ultimo passaggio, abbiamo bisogno di un eccesso di DNA dell'inserto rispetto al DNA plasmidico, per far sì che la maggior parte dei vettori incorpori l'inserto e venga richiusa. Bisogna ricordare, inoltre, che alcuni vettori non solo permettono l'isolamento e la purificazione di specifici DNA, ma sono anche in grado di dirigere l'espressione di geni all'interno del DNA inserito. Tali plasmidi vengono detti vettori d'espressione e possiedono promotori trascrizionali immediatamente adiacenti al sito di inserzione. In questo modo possiamo vedere l'espressione del tratto di DNA da noi inserito oppure ottenere grandi quantità della proteina prodotta dalla sequenza genica presa in considerazione.

Tratto da BIOLOGIA MOLECOLARE di Domenico Azarnia Tehran
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DNA
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