Mediante clonaggio si creano librerie di molecole di Dna

Una libreria di DNA è una popolazione di vettori identici, ciascuno contenente un inserto diverso di DNA. Per costruire una libreria, il DNA bersaglio (per esempio il DNA genomico umano) viene digerito con un enzima di restrizione che dà inserti della lunghezza media desiderata. Le dimensioni dell'inserto possono variare da meno di 100 paia di basi a più di una megabase. Il DNA tagliato viene quindi mischiato con il vettore appropriato tagliato a sua volta con lo stesso enzima di restrizione, in presenza di ligasi. Ciò produce un'ampia collezione di vettori con diversi inserti di DNA. Quindi, usando DNA da fonti diverse si possono generare vari tipi di librerie. Le più semplici originano da DNA genomico totale tagliato con un enzima di restrizione; queste si chiamano librerie genomiche. Questo tipo di libreria è utile principalmente per generare DNA per il sequenziamento di un genoma. Per arricchire la libreria di sequenze codificanti, si usa una libreria di cDNA. In quest'ultima, invece di usare DNA genomico come materiale di partenza, si usa mRNA che viene convertito in DNA. Il processo che consente questo passaggio è chiamato trascrizione inversa ed è svolta da una DNA polimerasi speciale (la trascrittasi inversa) che può generare DNA da uno stampo di RNA. Le sequenze di mRNA possono essere convertite in DNA copia a doppia elica, detti cDNA (ovvero DNA copia), quando vengono trattate con la trascrittasi inversa. Questi frammenti vengono, quindi, inseriti con la ligasi nei vettori.
Come abbiamo detto in precedenza, comunque, esistono vari vettori che possono contenere diverse paia di basi fino ad arrivare a 2000 kb nel caso del vettore YAC. Nel caso di quest'ultimo, però, non abbiamo enzimi che riescono a tagliare porzioni così grandi di DNA, per questo motivo, invece, di effettuare una digestione completa procediamo con una digestione incompleta. In questo modo avremo numerosi frammenti di poche coppie di basi (20 Kb nel caso di Sau3A) ma sovrapposti, che andranno a coprire tutta la regione di DNA che vogliamo clonare. A questo punto, con le metodologie precedentemente illustrate, cloniamo tutti i frammenti tramite il fago λ e otterremo la nostra genoteca.