Gli errori di replicazione e la loro riparazione

Con mutazioni di intende praticamente ogni possibile cambiamento nella sequenza del DNA. Le più semplici mutazioni sono date dal cambiamento di una base con un'altra e ne esistono di due tipi. Le transizioni consistono in sostituzioni di pirimidine con pirimidine, o purine con purine, quali per esempio un cambiamento da T a G o A e da A a C o T. Altre mutazioni semplici consistono nell'inserimento o nella delezione di un singolo nucleotide o di un piccolo gruppo di nucleotidi. Le mutazioni a carico di un solo nucleotide sono dette mutazioni puntiformi. Altre mutazioni, quali lunghe inserzioni o delezioni e grossi riarrangiamenti della struttura cromosomica, causano dei cambiamenti più drastici del DNA. In media la frequenza con cui una nuova mutazione insorge spontaneamente in un qualunque sito del cromosoma ha un valore compreso tra 10-6 e 10-11, per ciclo di replicazione, anche se vi sono alcuni siti del cromosoma detti “punti caldi” caratterizzati da una più elevata frequenza di mutazione. Uno di questi siti sono le sequenza note come DNA satellite, costituite da brevi ripetizioni del dinucleotide CA. Il macchinario replicativo ha delle difficoltà nel copiare in modo accurato queste ripetizioni, e spesso va incontro a fenomeni che causano l'allungamento o la riduzione del numero di ripetizioni (polimorfismo nella popolazione, usato come marcatore fisico). Comunque, come abbiamo già visto, l'apparato replicativo è caratterizzato da un'elevata accuratezza, grazie ad un sistema di correzione di bozze, dato dall'attività esonucleasica 3'→5' del replisoma, capace di rimuovere i nucleotidi incorporati in maniera scorretta. Questa attività di correzione di bozze aumenta la fedeltà della replicazione di un fattore 100. L'esonucleasi non è, comunque, infallibile ed alcuni nucleotidi, erroneamente incorporati, sfuggono al controllo portando ad un errore di appaiamento tra il filamento neosintetizzato e lo stampo. A questo punto, in un secondo ciclo di replicazione, il nucleotide scorrettamente incorporato, farà parte del filamento stampo e porterà all'incorporazione nel filamento di nuova sintesi di un nucleotide complementare, fissando quindi la mutazione.
Per fortuna esiste un sistema capace di riconoscere i mismatch e di ripararli. Il sistema di riparazione dei mismatch o mismatch repair (MMR), che aumenta la correttezza della sintesi del DNA di due o tre fattori di grandezza, è il principale responsabile della replicazione del DNA. Questo sistema di riparazione deve affrontare due problemi: deve analizzare l'intero genoma alla ricerca di errori nell'appaiamento delle basi e ripararli velocemente. Inoltre, lo stesso sistema deve sostituire il nucleotide sbagliato, nel nucleotide di neosintesi, e non quello corretto, presente sull'elica parentale. Si è visto, che i E. coli, la prima fase dell'MMR è costituita dal riconoscimento dei substrati da parte della proteina MutS, in forma di omodimero, grazie alla lieve distorsione che provocano gli appaiamenti errati. Il legame di MutS al substrato è stimolato da un secondo omodimero MutL, la cui funzione è probabilmente quella di molecular matchmaker in grado di accoppiare il riconoscimento del danno da parte di MutS con la tappa successiva in cui interviene l'endonucleasi MutH, un enzima che taglia il filamento nelle immediate vicinanze dell'appaiamento errato. A partire dal punto di incisione, l'elica di DNA viene srotolata dalla DNA elicasi II fino al punto dov'è situato il mismatch, e il filamento che lo contiene viene quindi degradato da esonucleasi a singolo filamento in grado di agire sia con direzionalità 5'→3' (RecJ e ExoVII), quindi dal taglio in 5' fino all'errore verso il 3', che 3'→5' (ExoI e ExoX, esonucleasi I e X), quindi dal taglio in 3' all'errore che si trova al 5'.. Infine la DNA polimerasi III, in presenza delle proteine SSB (Single Strand Binding), colma la discontinuità formatasi e la DNA ligasi salda definitivamente il filamento riparato. Ma come fa il sistema di riparazione di E. coli a riconoscere quali dei due nucleotidi scorrettamente appaiati deve sostituire? La Dam metilasi metila i residui di A su entrambi i filamento della sequenza 5'-GATC-3'. Questa sequenza è ampiamente rappresentata lungo l'intero genoma e quando una forca di replicazione passa sulla sequenza GATC, metilata su entrambi i filamenti, le molecole DNA figlie, a doppio filamento, risultano emimetilate. Perciò per alcuni minuti, fino a quando la Dam metilasi raggiunge e modifica il filamento di neosintesi, la doppia elica di DNA figlia è metilata solamente sul filamento che funge da stampo. Il filamento di nuova sintesi risulta quindi marcato (in quanto privo di gruppo metilico) e riconoscibile come filamento da riparare. Nelle cellule eucariotiche, invece, sono stati identificati due complessi in grado di riconoscere gli errori della replicazione, MutSα e MutSβ. Sia l'uno che l'altro contengono MSH2, che interagisce con MSH6 in MutSα e con MSH3 in MutSβ. Dati in vitro indicano che MutSα, il complesso più abbondante nelle cellule umane, riconosce preferenzialmente gli appaiamenti errati delle basi, mentre MutSβ sembra specificamente coinvolto nel riconoscimento di anse extra-elica maggiori di due nucleotidi. È stato ipotizzato inoltre che l'interazione di hMutSα e di altre proteine permetta di utilizzare i frammenti di Okazaki quale segnale di discriminazione tra l'elica parentale ed elica di nuova sintesi. Le interazioni potrebbero quindi favorire il distacco del complesso replicativo del filamento neosintetizzato, la degradazione nucleotidica a partire dall'estremità 3'-OH libera e il reclutamento dei fattori necessari per la sintesi riparativa. Comunque, nell'uomo l'inattivazione del MMR è associata con il cancro ereditario del colon di tipo non poliposico (Hereditary Non Polyposis Colon Cancer, HNPCC), i cui affetti sviluppano tumori ad un età relativamente giovane (40-50 anni). In famiglie affette da questo tumore si osserva anche un eccesso di tumori dell'ovaio, dello stomaco e della vescicola e si è visto che la maggior parte dei pazienti presenta mutazioni germinali in eterozigosi nei geni hMLH1 e hMSH2. Questi dati suggeriscono che l'inattivazione di questi due geni abolisca completamente il MMR, mentre difetti nelle altre proteine del MMR ne causino un difetto parziale.