Esportazione e secrezione delle proteine

Nei batteri Gram-negativi tutte questi polipeptidi devono oltrepassare diversi compartimenti prima di raggiungere il sito dove svolgere la loro attività biologica. Affinché questo avvenga le cellule batteriche sono dotate di sistemi di secrezione che guidano i polipeptidi in questo percorso. 

Come sappiamo le proteine presenti sulla membrana esterna (OM) definite OMP (Outer Membrane Protein) sono di due tipi: lipoproteine che sono legate alla membrana esterna tramite una coda lipidica N-terminale e proteine integrali di membrana che contengono diversi domini necessari per l'inserimento sulla membrana esterna. Comunque tutte le proteine della membrana esterna sono sintetizzate nel citoplasma come precursori con la sequenza segnale all'estremità N-terminale e sono trasportate attraverso la membrana interna tramite il sistema Sec. Si è calcolato che circa i due terzi delle proteine sintetizzate da un microrganismo vengono secrete ed esportate. 

Per esportazione si fa riferimento al trasferimento di una proteina da un compartimento cellulare ad un altro (dal citoplasma allo spazio periplasmatico), per secrezione facciamo riferimento al trasporto di una proteina all'esterno della cellula, invece per traslocazione si intende il trasferimento di una proteina da una cellula ad un'altra.
I ribosomi su cui vengono sintetizzate le proteine sono a volte chiamati “ribosomi liberi”, poiché costituiscono una frazione separata da quella delle membrane. 

La condizione di default di una proteina rilasciata da questi ribosomi consiste nel rimanere nel citosol; per essere indirizzata a una destinazione specifica, la proteina deve contenere un segnale appropriato che consiste tipicamente in una sequenza-motivo, dalla quale dipende la sua incorporazione in una struttura macromolecolare, o il suo riconoscimento da parte di un sistema di trasporto. Il processo di inserimento in una membrana, o del passaggio attraverso di essa, viene chiamato traslocazione delle proteine. 

Nelle proteine che si associano a membrane, il processo della traslocazione può avvenire con due modalità differenti. Le proteine dei mitocondri e dei cloroplasti vengono rilasciate nel citosol e in seguito si associano con le membrane dell'organello. Poiché questo processo avviene dopo la sintesi della proteina è giunta a completamento, si parla di traslocazione posttraduzionale. Altre proteine invece entrano nel reticolo endoplasmatico (ER) mentre sono ancora in fase di sintesi; il processo viene perciò chiamato traslocazione cotraduzionale. 

Poiché durante la sintesi di queste proteine i ribosomi sono associati alle membrane dell'ER sono talvolta chiamati “ribosomi attaccati a membrane” (nei batteri alcune proteine vengono secrete sia in fase co- che posttraduzionale). Comunque tutte le proteine che utilizzano sequenze N-terminali per il trasporto sia posttraduzionale che cotraduzionale presentano una caratteristica in comune: durante la traslocazione, la sequenza N-terminale viene tagliata via dalla catena proteica.

 Il terminale amminico comprende una sequenza leader (o guida) che non entra a far parte della proteina matura. La forma che porta la sequenza leader, chiamata preproteina, rappresenta un precursore transitorio della proteina matura. Bisogna ricordare che molte proteine mancano della capacità di autoassemblarsi e restano intrappolate in una conformazione stabile, che non corrisponde alla forma finale normale. In questi casi deve intervenire una chaperonina, cioè un chaperone molecolare, ad impedire che la proteina si stabilizzi in una conformazione inattiva. Quindi si può dire che le chaperonine sono proteine che mediano il corretto autoassemblaggio di una proteina bersaglio, facendo si che essa assuma solo una data conformazione tra le varie possibili. Inoltre esse sono essenziali nelle due fasi della produzione delle proteine che risiedono nelle membrane o che le devono attraversare. 

Come sappiamo la capacità di indirizzare una proteina verso una membrana è una proprietà intrinseca della sequenza leader. Ma l'avvio del ripiegamento della proteina costituisce un aspetto cruciale di ogni passaggio di membrana. Per questo le chaperonine possono impedire alle proteine di acquisire una conformazione che ne bloccherebbe il passaggio attraverso la membrana; in un caso di questo tipo, il ruolo della chaperonina consiste fondamentalmente nel mantenere la proteina in una forma flessibile e distesa, non ripiegata. Una volta che ha attraversato la membrana, la proteina può associarsi con un'altra chaperonina che l'aiuta ad assumere la conformazione matura.
Nei batteri Gram-negativi sono stati individuati almeno due sistemi di esportazione delle proteine nello spazio periplasmatico: il sistema SecA/B e il sistema SRP. In entrambi i casi si parla di sistemi di esportazione generali che sfruttano la presenza del segnale amminoacidico all'NH2 terminale della proteina. Questo segnale, dopo l'esportazione, viene eliminato da una peptidasi anch'essa non specifica. I due sistemi utilizzano il medesimo canale transmembrana per l'esportazione della proteina, ma si distinguono per il fattore che interagisce ed indirizza la proteina da esportare. Nella via Sec dipendente definita anche GSP (General Secretory Pathway) i polipeptidi che vengono trasportati tramite il GSP hanno una caratteristica sequenza-segnale alla estremità  N-terminale, chiamata anche peptide-leader, che è assente nella proteina matura. Questa sequenza è costituita da 18-26 amminoacidi come un modulo costituito da differenti sottodomini. 

La porzione idrofobica centrale è importante in quanto contiene il sito di taglio da parte della peptidasi-segnale. Solo per alcune proteine periplasmiche la sequenza-segnale è assente e questo significa che la sequenza della proteina matura ha di per sé tutte le informazioni necessarie al trasporto. Gli attori del sistema Sec sono: SecB è una chaperonina citoplasmatica che entra in contatto con la proteina da esportare in modo che questa non assumi una conformazione inadatta all'esportazione (è cruciale infatti che la sequenza segnale rimanga esposta in modo che possa interagire con il complesso di esportazione), SecA è una proteina con un attività ATPasica e in grado di interagire con Sec B quando questa ha catturato una proteina e fornisce l'energia per il passaggio attraverso la membrana consumando ATP e, infine, SecDEFGY formano un complesso transmembrana che permette l'esportazione della proteina attraverso la membrana esterna (YEG sono proteine transmembrana mentre D e F sono proteine della membrana interna ma rivolte verso lo spazio periplasmatico). 

Bisogna ricordare che insieme a Sec B, per ripiegarsi in modo corretto alcune proteine hanno bisogno dell'assistenza di chaperonine. In E.coli i quattro più importanti sono: DnaK, DnaJ, GroEL e GroES. DnaK e DnaJ sono enzimi ATP-dipendenti che legano i peptidi neosintetizzati rallentandone il ripiegamento in modo da favorirne uno esatto. Se il complesso DnaJ non è in grado di far assumere alla proteina il corretto folding può trasferire la proteina parzialmente ripiegata ai due complessi proteici GroEL e GroES. La proteina entra dentro GroEL, una grande proteina a forma di barile che usando energia dall'idrolisi di ATP e coadiuvata dal complesso GroES, ripiega correttamente la proteina. Nel  processo di traslocazione SecB interagisce con una regione di circa 180 amminoacidi della proteina da traslocare e la trasporta su SecA. Il processo funziona in differenti fasi in cui SecA trasloca circa 2,5 kDa alla volta. Il ruolo di SecD e SecF e YajC potrebbe essere quello di tenere aperto il passaggio nella membrana cellulare e garantire la fuoriuscita del pre-polipeptide che sarà poi processato in peptide. Nella fase del trasporto il legame di SecA con il precursore proteico si effettua con la sequenza segnale sia nel dominio terminale N che che con la regione centrale H. Il legame di SecA con la sequenza segnale stabilizza il legame con SecB e contemporaneamente causa la dissociazione della pre-proteina da SecB. Questo step determina il trasferimento della pre-proteina matura sul complesso delle translocasi.
Nel caso del sistema SRP (Signal Recognition Particle), invece, il processo è molto simile ma cambiano gli “attori”. In questo caso non abbiamo più le proteine SecA/B ma una piccola ribonucleoproteina (SRP) composta da una proteina (codificata dal gene ffh) e un piccolo frammento di RNA, che non appartiene a nessuna delle classiche classi di RNA (tRNA, mRNA o rRNA). Questo complesso quindi sostituisce funzionalmente (pur non agendo da chaperonina) la proteina SecB. Il complesso SRP riconosce la sequenza segnale che sporge dal ribosoma e si lega ad esso mediante Ffh. L'SRP legato al complesso ribosoma-catena nascente (RNC) si associa con il suo recettore citosolico FtsY. L'interazione tra FtsY e la subunità dell'SRP Ffh modifica l'affinità di legame per il GTP di entrambe le proteine consentendo a ciascuna di legare il GTP. Nella fase successiva il complesso SRP-RNC-FtsY si lega alla membrana. L'idrolisi del GTP determina la dissociazione del complesso SRP-RNC-FtsY che interagendo con SecYEG  permette l'esportazione della proteina attraverso il complesso transmembrana.
In aggiunta al sistema Sec ed a quello SRP abbiamo il sistema TAT (Twin Arginine Translocation) che agisce su quelle proteine che hanno in caratteristico motivo amminoacidico che include almeno due residui contigui di arginina nella sequenza segnale. Questo rende quest'ultima meno riconoscibile dal sistema Sec. In questo sistema non c'è bisogno di mantenere la proteina “unfolded” in quanto questa si trova già in un corretto ripiegamento. Questo sistema si occupa specificamente di proteine che si legano ad altri patners per formare complessi che vengono poi traslocati. In Escherichia Coli almeno 22 polipeptidi vengono traslocati dal sistema TAT che consta di quattro proteine integrali di membrana: TAT A, TAT B, TAT C E TAT E, il cui rispettivo ruolo nel processo di traslocazione non ancora chiarito. Il ciclo inizia quando la sequenza segnale contenente le due arginine si lega al complesso di membrana TAT BC. 

Questo motivo è riconosciuto da TAT C. Sfruttando la forza proton-motrice TAT A si dirige verso TAT BC. La proteina a questo punto viene traslocata attraverso il poro formato da TAT A. Alla fine il complesso TAT BC si dissocia da TAT A.
Bisogna dire che in qualunque sistemi si parli le proteine della membrana esterna contengono un numero di foglietti β che si ripiegano in una struttura a β barrel (come un canale) con i residui idrofobici rivolti verso l'esterno. Nello spazio periplasmatico si trovano: Skp, una proteina che si lega alle proteine della membrana esterna non appena emergono dal canale Sec e prevengono il ripiegamento incorretto e l'aggregazione, SurA, una proteina che contribuisce al corretto ripiegamento delle proteine della membrana esterna e Dps AC che induce la formazione dei ponti disolfuro delle proteine della membrana esterna prima che siano inserite nella membrana suddetta.
Come sappiamo altri importanti componenti della membrana esterna sono le lipoproteine che sono ancorate a quest'ultima tramite l'estremità N-terminale della N-acyl diacylglyceril cisteina (cisteina lipidata). Il processo di lipidazione e il corretto ripiegamento ha luogo dopo che la lipoproteina ha attraversato la membrana interna. Per attraversare lo spazio periplasmatico la lipoproteina ha bisogno del complesso LolCDE, localizzato nella membrana interna, che contiene un ATP binding cassette. L'energia derivante dall'idrolisi di LolD viene trasferita a LolC e LolE che la utilizzano per aprire la cavità di LolA in modo che possa legarsi la lipoproteina. 

Il complesso LolA-lipoproteina attraversa il periplasma e raggiunge LolB, il recettore nella membrana esterna. Per una maggiore affinità della lipoproteina per LolB, essi si legano e si inseriscono nella membrana esterna.
Invece, i diversi costituenti del lipopolisaccaride: lipide A, core polisaccaridico e le eventuali estensioni polisaccaridiche (antigene O) sono sintetizzate nel citoplasma a contatto con la membrana interna. La traslocazione del lipide A e del core è mediata da MsbA, un trasportatore della membrana interna di tipo ABC (mutanti MsbA accumulano LPS nella membrana interna). MsbA è presente anche nei batteri Gram-positivi dove svolge il ruolo di trasportatore di antibiotici verso l'esterno. Per quanto riguarda l'antigene O dobbiamo dire che è fortemente idrofilico e per attraversare la membrana interna richiede come trasportatore il bactoprenolo, un alcol a 55 atomi di carbonio che trasporta anche i componenti del peptidoglicano. Il legame invece tra il lipide A e il core polisaccarido dell'antigene O avviene nello spazio periplasmatico. Nella membrana esterna è necessaria la proteina IMP (Increased Membrane Permeability) per il corretto posizionamento dell'LPS. IMP potrebbe svolgere il ruolo di flippasi facendo ruotare LPS verso il foglietto esterno della membrana esterna. Vi sono due ipotesi per spiegare l'attraversamento del periplasma:
1.una chaperonina periplasmatica riconosce LPS e poi lo rilascia alla proteina IMP
2.si creano delle zone di contatto tra la membrana interna e la membrana esterna con un traslocatore costituito dal contatto diretto tra MsbA e IMP.
In tutti questi sistemi le proteine destinate a risiedere nelle membrane possiedono anche un secondo segnale chiamato segnale di fine del trasferimento (stop-transfer signal) che assume la forma di un gruppo di amminoacidi che funge da ancoraggio alla membrana impedendo alla proteina di attraversarla del tutto. 

Le proteine che vengono secrete, invece, al di fuori della cellula hanno cinque strategie di uscita che vengono suddivise in altrettanti gruppo definiti con numeri romani. Di  Tipo I, in cui la proteina non ha bisogno di una sequenza segnale ed è specifico per l'emolisina (una tossina in grado di ledere i globuli rossi), di Tipo II, in cui molte proteine sono necessarie per l'attraversamento della membrana esterna specifiche per ogni proteina secreta, di Tipo III, un sistema costituito da 15 proteine in grado di iniettare proteine dal batterio direttamente alla cellula bersaglio come una sorta di pistola per questo è considerato un organello negli organismi patogeni, di Tipo IV, in cui è mediato il trasferimento di DNA o proteine tra cellule batteriche o/a cellule di funghi, piante o animali e di Tipo V, o autotrasportatori che utilizzano il sistema Sec per attraversare la membrana interna.