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Proteomica comparativa applicata allo studio di specifici profili proteici

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Tesi  di  Laurea  Magistrale  in   Scienze  Chimiche     Antonio  Rosato     Indice       INDICE   INDICE   _________________________________________________________________________________________________________   I   1.  INTRODUZIONE   __________________________________________________________________________________________   1   2.   CONTESTO  APPLICATIVO   ____________________________________________________________________________   2   2.1.   IL  MORBO  DI   PARKINSON  _____________________________________________________________________________   2   2.1.1.   Eziologia   _______________________________________________________________________________________   3   2.1.2.   Fibroblasti  come  cellule  modello  per  lo  studio  del  Parkinson   _______________________________   3   3.   LA  PROTEOMICA  ______________________________________________________________________________________   4   3.1.1.   Proteomica  e  studio  delle  modificazioni  post -­‐traduzionali  (PTMsonica)  __________________   5   3.2.   TECNOLOGIE  _________________________________________________________________________________________   7   3.3.   ELETTROFORESI  BIDIMEN SIONALE   ____________________________________________________________________   8   3.3.1.   Preparazione  dei  campioni  per  l’analisi  _____________________________________________________   9   3.3.2.   Dosaggio  delle  proteine   _____________________________________________________________________  11   3.3.3.   La  focalizzazione  isoelettrica  (IEF)  ________________________________________________________  12   3.3.4.   Poliacrilamide  gel  Elettroforesi  (SDS -­‐PAGE)  ______________________________________________  14   3.3.5.   Rivelazione  delle  proteine  sul  gel   ___________________________________________________________  15   3.3.6.   Analisi  delle   immagini  ______________________________________________________________________  16   3.4.   IDENTIFICAZIONE  DELLE   PROTEINE:  SPETTROMETRIA  DI   MASSA   _____________________________________   17   3.4.1.   Proteomica  e  spettrometria  di  massa:  Sorgenti  tipiche   ___________________________________  18   3.4.2.   M.A.L.D.I.   _____________________________________________________________________________________  18   3.5.   ANALIZZATORI  DI  MASSA  ___________________________________________________________________________   20   3.5.1.   TOF   ___________________________________________________________________________________________  20   3.5.2.   Reflectron:  Aumento  della  Risoluzione   _____________________________________________________  21   3.6.   PEPTIDE   MASS   FINGERPRINT   _______________________________________________________________________   22   3.6.1.   Digestione  degli  spot   ________________________________________________________________________  22   3.6.2.   Perché  la  tripsina?  __________________________________________________________________________  23   3.6.3.   Match  mancanti   _____________________________________________________________________________  24   3.7.   ANALISI  DEI  RISULTATI   TRAMITE  BIOINFORMATI CA   __________________________________________________   25   3.7.1.   Identificazione  delle  proteine   _______________________________________________________________  25   3.7.2.   Il  software  di  ric erca  MASCOT  e  valutazione  del  risultato   ________________________________  26   4.   ATTIVITA’  SVOLTA   __________________________________________________________________________________   28   4.1.   ALLESTIMENTO  DELLE   COLTURE  DI  FIBROBLAST I   ____________________________________________________   28   4.2.   ELETTROFORESI   BIDIMENSIONALE   __________________________________________________________________   29   4.2.1.   Preparazione  delle  proteine  cellulari  ______________________________________________________  29   Tesi  di  Laurea  Magistrale  in   Scienze  Chimiche     Antonio  Rosato     Indice       4.2.2.   Isoelettrofocalizzazione  delle  proteine   _____________________________________________________  30   4.2.3.   Equilibrazione  delle  Strip   ___________________________________________________________________  30   4.2.4.   Seconda  dimensione:  SDS -­‐PAGE   ____________________________________________________________  31   4.3.   IDENTIFICAZIONE  DELLE   PROTEINE   _________________________________________________________________   32   4.3.1.   Digestione  in  gel  di  proteine  separate  tramite  elettroforesi  ______________________________  32   4.3.2.   Descrizione  dello  spettrometro  MALDI  utilizzato  per  le  analisi  __________________________  33   4.3.3.   Preparazione  dei  Campioni  per  l’Analisi:  deposizione  degli  spot  sulla  target-­‐ plate   _____  34   4.3.4.   Deposito  della  miscela  di  calibrazione  _____________________________________________________  34   4.3.5.   Acquisizione  degli  spettri  ___________________________________________________________________  35   4.3.6.   Elaborazione  dei  segnali  e  ricerca  in  banca  dati  __________________________________________  35   5.   RISULTATI  E  DISCUSSI ONE  ________________________________________________________________________   36   5.1.   GEL   BIDIMENSIONALI   _______________________________________________________________________________   36   5.2.   ANALISI  MEDIANTE  SPET TROMETRIA  DI  MASSA   ______________________________________________________   40   5.2.1.   Analisi  degli  spot  ____________________________________________________________________________  40   5.2.2.   Risultati  delle  identificazioni  _______________________________________________________________  41   5.2.3.   La  Vimentina   ________________________________________________________________________________  54   6.   STUDIO  DELLE  MODIFICHE  POST-­‐ TRADUZIONALI  DELLA  VIMENTINA  ____________________   56   6.1.   FOSFORILAZIONE  E  FOSF OPROTEOMICA   _____________________________________________________________   57   6.1.1.   Risultati  della  ricerca  in  banca  dati  per  le  fosforilazioni   __________________________________  60   6.1.2.   Ricerca  dei  segnali  di  de -­‐fosforilazione  ____________________________________________________  72   6.1.3.   Defosforilazione  in  situ  con   alcalin-­‐fosfatasi  ______________________________________________  73   6.1.4.   Studio  delle  Acetilazioni  ____________________________________________________________________  74   6.1.5.   Ricerca  delle  acetilazioni  ___________________________________________________________________  75   6.1.6.   Ricerca  delle  acetilazioni  e  delle  fosforilazioni  sullo  stesso  peptide  ______________________  82   7.   CONCLUSIONI   ________________________________________________________________________________________   92   8.   APPENDICE   ___________________________________________________________________________________________   93   8.1.   SPETTRI  DI   MASSA  DEI  CAMPIONI  NO N  TRATTATI  CON  FOSFA TASI  ALCALINA   _________________________   93   8.2.   SPETTRI  DI  MASSA  DEI   CAMPIONI  TRATTATI  CO N  FOSFATASI  ALCALINA   _______________________________   99   9.   NOTE  PERSONALI  _________________________________________________________________________________  105   10.   BIBLIOGRAFIA  ___________________________________________________________________________________  109  
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Proteomica comparativa applicata allo studio di specifici profili proteici

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Informazioni tesi

  Autore: Antonio Rosato
  Tipo: Laurea liv.II (specialistica)
  Anno: 2012-13
  Università: Università degli Studi di Bari
  Facoltà: Chimica
  Corso: Scienze chimiche
  Relatore: Gerardo Palazzo
  Lingua: Italiano
  Num. pagine: 117

FAQ

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Parole chiave

database
proteomica
maldi-tof
elettroforesi bidimensionale
modifiche post-traduzionali

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