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Due metodi innovativi per correggere la trisomia 21: silenziamento mediato da XIST e rimozione del cromosoma extra

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INDICE RIASSUNTO 1 ABSTRACT 3 INTRODUZIONE 5 La cromatina 5 Compensazione del dosaggio dei geni sul cromosoma X 5 Le aneuploidie 7 La sindrome di Down 7 Patogenesi della sindrome di Down 8 MATERIALI E MOTODI 10 Derivazione delle iPSC e differenziamento 10 Produzione del vettore AAV 11 Gene targeting mediato da AAV 12 Selezione con GCV contro il gene TKNEO 13 Analisi di Southern Blot quantitativa 13 Calcole del tempo di duplicazione della popolazione in colture miste 14 Curva di crescita 14 Analisi dei polimorfismi a singolo nucleotide degli alleli APP 14 Analisi della mutazione della porzione codificante di TKNEO 15 Formazione del teratoma e istologia 15 Analisi del cariotipo 15 Analisi di microarray 16 Interpretazione dei dati dell’analisi di microarray di Lawrence e colleghi 16 Coltura cellulare 17 Progettazione di Nucleasi Zinc Finger 17 Costruzione del plasmide con XIST e del plasmide con rtTA/puro 19 Integrazione genica mirata in cellule ips DS e generazione di cloni marcati in modo stabile dal gene XIST 19 DNA/RNA FISH e immunocolorazione 20 qRT-PCR 21 Analisi di proliferazione cellulare 21 Differenziamento in progenitori neurali e irreversibilità del silenziamento del cromosoma 21 marcato in neuroni corticali 22 Inserzione genica mirata in fibroblasti primary 23 RISULTATI 25 Trisomy correction in Down syndrome induced pluripotent stem cells 25 Formazione di trasformanti portanti il gene TKNEO 25 Induzione e verifica della perdita di una copia del cromosoma 21 27 Analisi sul fenotipo cellulare 30 Analisi sul profilo di espressione 31 Studi sul differenziamento cellulare 32 Translating dosage compensation to trisomy 21 34 Inserimento di XIST nel cromosoma 21 34 L’RNA di XIST induce un corpo di Barr sul cromosoma 21 39 Silenziamento allele-specifico lungo il cromosoma 21 40 Silenziamento a livello genomico 42 Impatto del silenziamento mediato da XIST su caratteristiche fenotipiche 43 Stabilità del differenziamento ed inserimento di XIST in cellule Differenziate 45 DISCUSSIONE 48 BIBLIOGRAFIA RINGRAZIAMENTI ARTICOLI
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Informazioni tesi

  Autore: Simona Sala
  Tipo: Laurea liv.I
  Anno: 2013-14
  Università: Università degli Studi di Milano - Bicocca
  Facoltà: Scuola di scienze
  Corso: Biotecnologie
  Relatore: Michela Clerici
  Lingua: Italiano
  Num. pagine: 70

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Parole chiave

trisomia 21
sindrome di down
xist
tkneo
silenziamento cromosomico
zinc finger nucleasi
gene targeting
integrazione genica mirata

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