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Studio mediante spettroscopia 1H e 31P RMN, del metabolismo energetico di epatociti intrappolati in gel di alginato e perfusi in bioreattore

Studio mediante spettroscopia 1H e 31P RMN, del metabolismo energetico di epatociti intrappolati in gel di alginato e perfusi in bioreattore
Dott.ssa Mirna Mercuri


Negli ultimi anni ha assunto sempre più importanza l’impiego di modelli di coltura di epatociti isolati, da utilizzare per lo studio del metabolismo cellulare, della citotossicità, dell’effetto di farmaci e del metabolismo xenobiotico. Il sistema da noi utilizzato è rappresentato da epatociti di ratto, intrappolati in sferule di gel di alginato e perfusi in bioreattore a letto fisso.
L’intrappolamento in condizioni non traumatiche in matrici di gel di alginato si è rilevato un metodo per la coltura di epatociti con mantenimento della vitalità e funzionalità metabolica a breve e lungo termine. Tale sistema offre la possibilità di ripristinare i contatti cellula-cellula e di indurre la formazione di componenti della matrice extracellulare,permettendo così l’ottenimento di un’appropriata citoarchitettura. Sono state determinate le condizioni di funzionamento ottimali per quanto riguarda le densità cellulari studiando lo stato metabolico mediante H e P RMN come pure la velocità di consumo d’ossigeno.
Le indagini mediante RMN di H e P eseguiti sul medium di perfusione hanno permesso di valutare le variazioni di questo dipendenti dall’interazione con la matrice di gel di alginato e di determinare qualitativamente e quantitativamente metaboliti quali glucosio, lattato, 3-OH butirrato, acetato etc.
Le indagini eseguite mediante p RMN su cellule e loro estratti, insieme alla determinazione della velocità di consumo di ossigeno, ha permesso di determinare lo stato del metabolismo energetico nelle cellule inglobate nel nostro sistema che risulta del tutto simile a quello del metabolismo epatico nel periodo “assorbitivo”.
infine le indagini eseguite mediante microscopia elettronica hanno evidenziato la tendenza a ricostituire nelle condizioni di una polarità cellulare ed una appropriata citoarchitettura.
In conclusione la presente tesi ha confermato la validità del sistema di coltura cellulare realizzato nel nostro laboratorio, e specialmente le potenzialità della metodica di RMN quale tecnica non invasiva per lo studio del metabolismo cellulare sia in “vivo” che in “vitro”.

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1 INTRODUZIONE Epatociti isolati sono stati ampiamente usati come modello sperimentale per lo studio del metabolismo cellulare, dell’effetto di farmaci, della citotossicità come pure del metabolismo di xenobiotici. L’uso delle colture cellulari primarie di epatociti per lo studio delle funzioni epatiche ha mostrato diversi vantaggi rispetto ai modelli animali: - le condizioni sperimentali che possono essere controllate rigorosamente; - una richiesta di quantità inferiore di materiale; - una semplificazione della sperimentazione; - la possibilità di evitare gran parte delle variabili presenti negli esperimenti “in vivo” (come ad esempio: contributi da altri tessuti o da altri tipi cellulari); - l’ottenimento di più campioni da un singolo animale; - la possibilità di effettuare studi su epatociti provenienti anche da fegati umani. Il vantaggio dell’impiego di epatociti isolati a fresco è dovuto anche alla analogia metabolica con lo stato nativo “in vivo”, tanto che il metabolismo delle cellule isolate può riflettere lo stato nutrizionale del fegato prima dell’isolamento cellulare. Tuttavia, è noto che epatociti in sospensione nel medium vanno incontro all’interno di poche ore a drammatici cambiamenti morfologici e biochimici, limitando così il loro impiego negli studi metabolici che implicano la

Tesi di Laurea

Facoltà: Scienze Matematiche, Fisiche e Naturali

Autore: Mirna Mercuri Contatta »

Composta da 102 pagine.

 

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