Caratterizzazione di nuovi inibitori non-nucleosidici della trascrittasi inversa di HIV-1 della classe N,N-DABO

La trascrittasi inversa (RT) del virus dell’immunodeficienza umana di tipo 1 (HIV-1) è un enzime che possiede un ruolo chiave nel ciclo infettivo che porta alla sindrome da immunodeficienza acquisita (AIDS) e di conseguenza rappresenta uno dei bersagli principali della terapia antiretrovirale. Gli inibitori della RT si possono dividere in due classi: gli inibitori nucleosidici (NRTI) e gli inibitori non-nucleosidici (NNRTI). Quest’ultimo gruppo di composti, oggetto del mio lavoro di tesi, pur presentando un’ampia eterogeneità di strutture chimiche, è accomunato da uno stesso meccanismo d’azione; gli NNRTI, infatti, interagiscono in maniera non competitiva con un sito allosterico della RT, adiacente al sito catalitico. Il presentarsi di una o più sostituzioni di singoli amminoacidi in questo sito di legame può conferire cross-resistenza da parte del virus nei confronti di più NNRTI. Lo scopo della mia ricerca è quindi stato identificare molecole che avessero una buona attività inibitoria nei confronti della forma wild type dell’enzima, ma che fossero attivi anche sulle forme mutanti, in particolare K103N e Y181I, poiché queste mutazioni, oltre ad essere le più diffuse, portano resistenza a tutti i farmaci NNRTI attualmente utilizzati.
Nel presente lavoro sono stati studiati i composti della classe DABO (diidro-alcossi-benzil-ossipirimidine), in collaborazione con il Prof. Antonello Mai (Università degli studi di Roma “La Sapienza”), il cui gruppo si è occupato della sintesi chimica. In particolare sono stati testati i derivati N,N-DABO, poichè si erano dimostrati efficaci a largo spettro sulle forme mutanti di RT. Abbiamo determinato l’attività inibitoria e il meccanismo d’azione dei derivati 2-cloro-6-fluoro-N,N-DABO e abbiamo investigato, mediante test di analisi cinetica, l’affinità degli inibitori in esame per ciascuno dei tre complessi catalitici, formati da enzima e rispettivi substrati (acido nucleico e nucleotide), valutando la stabilità di questi ultimi attraverso la determinazione delle velocità di associazione (kon) e di dissociazione (koff) degli inibitori dal sito allosterico di RT. I risultati ottenuti sono stati confrontati con quelli ricavati da precedenti studi sui composti 2,6 F2-sostituiti, i quali presentavano basse velocità di dissociazione dall’enzima (tight-binding), indicando un’ottima stabilità del legame, ma valori altrettanto bassi di velocità di associazione (slow-binding). Abbiamo osservato dei miglioramenti interessanti: i valori di kon dei 2,6-Cl,F-derivati, principalmente dei composti MC1838 e MC1839, sono decisamente più alti, soprattutto nell’associazione all’enzima wt libero [E] e al complesso binario con l’acido nucleico [E:NA]. Inoltre, i risultati ottenuti sui mutanti K103N e Y181I indicano, rispetto ai precedenti derivati, un’attività inibitoria maggiore, dovuta probabilmente ad un legame più stabile, in particolare al complesso ternario con acido nucleico e nucleotide [E:NA:dNTP].
Dall’esito di questo lavoro si può evincere che i composti testati potrebbero trovare applicazioni cliniche significative nella terapia antiretrovirale, sebbene siano necessari ulteriori approfondimenti tossicologici e farmacologici. Questi dati possono essere inoltre utili per studi di interazione molecolare con l’enzima RT, permettendo l’identificazione di nuovi derivati.