Produzione di una libreria di RNA di 60 nucleotidi di lunghezza a sequenza casuale e sua esplorazione funzionale. Implicazioni per l’origine della Vita.

In un contesto generale di ricerca nel campo dell' origine della Vita, il lavoro svolto per la mia tesi di laurea rientra in un progetto di ampio respiro indirizzato verso la caratterizzazione e l’individuazione di quei biopolimeri che la Natura non ha utilizzato per la realizzazione dell’ “edificio” Vita: i “Never Born Biopolimers” (NBB) (Luisi et al., 2006).
L’interesse per questa problematica nasce da considerazioni di carattere evoluzionistico secondo le quali l’evoluzione naturale non avrebbe esplorato tutto il possibile spazio delle sequenze dei biopolomeri (Monod, 1971; Gould, 1989; Luisi, 2003; Smith, 1970), così che potrebbe esserci un intero universo di questi, le cui proprietà attendono di essere svelate.
Nell’ambito di questo lavoro sono state poste le basi per lo studio delle proprietà funzionali di una libreria “random” di RNA al fine di determinare se le capacità funzionali siano proprietà comuni dell’acido ribonucleico o un raro risultato della selezione naturale.
Durante la prima fase del progetto, una libreria di DNA codificante per RNA a sequenza casuale della lunghezza di 60 nucleotidi è stata costruita e clonata in un opportuno vettore per la trascrizione. L’analisi della complessità della libreria ha dimostrato che questa codifica per 0,85x107 sequenze casuali diverse di RNA.
La fase successiva è stata dedicata all’allestimento di una strategia sperimentale per l’isolamento, a partire dalla popolazione di RNA codificata dalla libreria, di quelle sequenze che mostrassero possedere una determinata funzione. Questo è stato possibile sfruttando una tecnica molto utilizzata in esperimenti di evoluzione molecolare: l’in vitro evolution (Joyce, 2004). Questa metodologia, che si basa sui principi basilari della teoria evoluzionistica darwiniana, permette di esplorare le capacità funzionali di DNA, RNA e proteine in maniera rapida, sistematica e diretta.
Si è deciso di selezionare la popolazione di RNA alla ricerca di molecole di acido ribonucleico con la capacità di idrolizzare il legame peptidico. Per far questo, il pool di RNA è stato selezionato per la capacità di riconoscere un analogo dello stato di transizione (Transition State Analogue, TSA) di reazioni peptidasiche: questa molecola mima geometricamente la struttura del complesso altamente instabile che si forma come intermedio nelle reazioni catalizzate di idrolisi del legame peptidico. Secondo la teoria dello stato di transizione i catalizzatori enzimatici sono quelle molecole in grado di riconoscere questo intermedio, stabilizzarlo e guidarlo verso la formazione dei prodotti. Quindi nel nostro esperimento di in vitro evolution le sequenze che mostreranno di riconoscere le molecole di TSA saranno considerate dei candidati per possedere la funzione peptidasica.
I risultati preliminari ottenuti hanno mostrato la validità del metodo adottato, consentendo il successivo passaggio di selezione ed isolamento di molecole di RNA con possibile attività peptidasica.