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Ruolo di un RNA antisenso nella modulazione dei geni di invasività in Shigella

Shigella costituisce un interessante modello per lo studio dell’espressione genica, in quanto i geni necessari per il processo di invasività sono silenziati al di fuori dell’unico ospite, l’uomo. La maggior parte dei geni di invasività in Shigella è localizzata all’interno di una grande “Isola di patogenicità” (PAI) sul plasmide di 220 kb, denominato pINV.
Il mio lavoro di tesi si inserisce nell’ambito di una linea di ricerca rivolta allo studio della regolazione del gene di virulenza plasmidico icsA, denominato anche virG. Il gene icsA è di fondamentale importanza nel processo di infezione di Shigella, in quanto codifica per una proteina essenziale per il meccanismo di motilità actina-dipendente tramite il quale il batterio si muove nel citoplasma della cellula ospite e si propaga alle cellule adiacenti. Per caratterizzare il ruolo di questo ncRNA, definito da noi aRNAG, nella modulazione dell’espressione del gene icsA di Shigella, ho isolato, tramite mutagenesi sito specifica dei mutanti nella regione -10 del promotore dell’aRNAG e del gene icsA. I frammenti contenenti le regioni -10 mutate dei PicsA e PaRNAG selvatiche e mutanti, sono stati clonati in un vettore per fusioni trascrizionali contenti il gene reporter lacZ per analizzare il ruolo dei due promotori convergenti nell’interferenza trascrizionale. I dati ottenuti suggeriscono che la presenza della molecola di aRNAG, sia in cis che in trans, induce una severa riduzione dell’espressione del gene icsA.
Infine dal momento che i geni di invasività di Shigella sono sottoposti al controllo da parte della proteina del nucleoide H-NS e dell’attivatore trascrizionale VirF ho verificato, dopo aver trasferito le diverse fusioni trascrizionali da me isolate sul cromosoma di E.coli, quale fosse il ruolo svolto da H-NS e da VirF nella regolazione sia del gene icsA che dell’aRNAG.

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5 INTRODUZIONE 1.1 Piccoli RNA non codificanti nei batteri Tradizionalmente all’RNA si associano due ruoli principali: quello di trasferire l’informazione genetica sottoforma di mRNA e quello di intervenire nella sintesi proteica come rRNA e tRNA. In aggiunta a ciò, le attività catalitiche degli RNA (ribozimi) e di piccoli RNA non codificanti, sono considerate fondamentali in processi post-trascrizionali come lo splicing e le modificazioni dell’rRNA negli eucarioti. Nei batteri al contrario, il potenziale regolatorio dell’RNA sembra essere svolto principalmente da piccoli RNA che controllano diverse funzioni biologiche accessorie dei microbi. Recentemente sono stati identificati circa 140 “small RNA” (sRNA) non codificanti nei batteri, la maggior parte dei quali si trova in E.coli, mentre un numero minore è stato caratterizzato in altri microrganismi, molti dei quali patogeni come Bacillus Subtilis, Vibrio cholerae, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus e Listeria monocytogenes (Altuvia, 2007). Per via della loro piccola taglia (40-500 ntd) l’identificazione tramite metodi biochimici o genetici di questi sRNA risulta piuttosto complicata. Inoltre non essendo tradotti in proteine, mutazioni nonsenso o di spostamento del modulo di lettura non hanno alcun effetto. Per la stessa ragione è impossibile predire attraverso le convenzionali elaborazioni algoritmiche l’esistenza di geni codificanti questi piccoli RNA che si basano proprio sulla presenza di sequenze codificanti proteine (Hershberg et al., 2003). E’ stato osservato che questi RNA regolatori sono coinvolti nel controllo di diversi processi quali la replicazione plasmidica, la trasposizione negli eucarioti e nei procarioti, la replicazione fagica e virale, la virulenza batterica, le risposte batteriche a cambiamenti ambientali e nel controllo dello sviluppo negli eucarioti inferiori (Hildebrandt & Nellen, 1992; Lankenau et al., 1994; Morfeldt et al., 1995; Sharp et al., 1993; Wagner & Simons, 1994; Wassarman et al., 1999; Wightman et al., 1993). Tuttavia la funzione di molti sRNA rimane ancora da chiarire, anche se da numerosi studi sono stati identificati tre generali meccanismi d’azione di queste piccole molecole. Alcuni sRNA sono parte integrante di complessi RNA-proteina come l’RNA 4.5S che interviene nella secrezione delle proteine e l’RNasiP che possiede attività catalitica in vitro. Alcuni sRNA invece mimano le strutture di altri acidi nucleici; un esempio è RNA 6S che lega il fattore σ 70 dell’RNA polimerasi, cambiando l’affinità di quest’ultima per il promotore. Gli sRNA CsrB e CsrC, invece,

Laurea liv.II (specialistica)

Facoltà: Scienze Matematiche, Fisiche e Naturali

Autore: Manu Bianco Contatta »

Composta da 117 pagine.

 

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Disponibile in PDF, la consultazione è esclusivamente in formato digitale.