Studio della dinamica e della struttura dell'insulina tramite spettroscopia neutronica e dicroismo circolare

L’insulina è un ormone fondamentale per l’organismo umano in quanto consente al glucosio l’ingresso nelle cellule e il suo conseguente utilizzo come fonte energetica. In alcune condizioni, l’insulina puo' formare fibrille amiloidi e dare luogo a una patologia, l’amiloidosi iatrogena dell’insulina, che provoca complicanze nella cura del diabete. I meccanismi che portano alla
formazione di queste fibrille non sono ancora stati compresi. Data la complessita' del problema e la scarsita' di informazioni al riguardo, è` utile effettuare studi in vitro in cui le condizioni di eventuale formazione delle fibrille possano essere meglio controllate. In questo ambito, il primo passo è quello di studiare le trasformazioni strutturali, e dinamiche, della molecola di insulina al variare di parametri esterni, quali la temperatura. Il comportamento dell’insulina può essere quindi confrontato con quello di altre molecole che generano fibre amiloidi, quali la mioglobina, su cui in letteratura si possono trovare numerosi dati.
In questa tesi ho studiato i cambiamenti dinamici e strutturali dell’insulina bovina in funzione della temperatura. Per questo studio abbiamo svolto esperimenti presso l’istituto Laue-Langevin di Grenoble, utilizzando due diverse tecniche: (1) il dicroismo circolare, per determinare le variazioni
strutturali della proteina in soluzione per temperature da 20 a 95o C; (2) la spettroscopia neutronica, per comprendere le transizioni dinamiche di una polvere di insulina entro un intervallo da -253 a 27o C. In entrambi i casi, i risultati ottenuti sono stati confrontati con quelli di analoghi esperimenti sulla mioglobina, in parte svolti in questa tesi e in parte rianalizzati.
Per quanto riguarda i cambiamenti strutturali, abbiamo visto che l’insulina è molto più resistente a subire variazioni indotte dalla temperatura rispetto alla mioglobina: a 95o C l’insulina subisce una transizione da uno stato monomerico ad uno intermedio reversibile mentre la mioglobina nel-
lo stesso intervallo di temperatura passa da uno stato monomerico ad uno stabile caratterizzato dalla formazione di fibre amiloidi. Un confronto con altre proteine, in grado di formare aggregati amiloidi all’aumentare della temperatura, ha confermato che l’ormone da noi studiato presenta una temperatura di transizione, grandezza che evidenzia il passaggio tra due stati stabili, notevolmente maggiore e quindi ha una notevole resistenza a modificare la propria struttura. Dagli esperimenti di spettroscopia neutronica svolti sia su insulina in polvere idratata al 15%, sia su mioglobina liofilizzata allo stesso stato di idratazione abbiamo visto che, anche dal punto di vista della dinamica, l’insulina è poco incline a subire variazioni. Inoltre abbiamo confrontato i nostri risultati con quelli ottenuti dal Professor Cupane e dal Dottor Schirò su un campione di mioglobina completamente disidratata. L’andamento dell’insulina, contrariamente a quanto ci si aspetta, si avvicina di più alla proteina di riferimento disidratata rispetto a quella allo stesso grado di idratazione.
Questi risultati sono stati confermati anche da un’analisi termodinamica tramite il modello di Doster e dal confronto delle costanti elastiche e pseudo-elastiche ottenute con il modello di Zaccai. Il nostro studio ha portato alla conclusione che l’insulina sia una molecola resistente alle variazioni termiche in quanto presenta una notevole “rigidità”, sia strutturale, che impedisce la formazione di fibre o la degradazione a temperature minore dei 95° C, sia dinamica, avvicinandosi maggiormente al comportamento di una proteina di riferimento disidratata che a quello di una proteina dello stesso grado di idratazione.