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Mutagenesi razionale su beta-lattoglobulina bovina tesa a chiarirne i meccanismi di dimerizzazione in dipendenza del pH

La possibilità di sostituire uno o più aminoacidi di una proteina permette di affrontare lo studio dei meccanismi molecolari che regolano le interazioni intra e intermolecolari e quindi i meccanismi di folding, di legame dei substrati e ligandi, di interazioni proteina-proteina.
In questo lavoro sperimentale la mutagenesi sito-diretta è stata utilizzata per acquisire nuove conoscenze sulle relazioni struttura-funzione nella Beta-lattoglobulina bovina.
La Beta -lattoglobulina bovina (Beta -LG) è una proteina di 18 kDa presente nel latte di alcuni mammiferi ed appartiene alla superfamiglia delle lipocaline. Le proteine appartenenti a questa superfamiglia svolgono una notevole varietà di funzioni biologiche, hanno sequenze scarsamente conservate, ma mostrano un fold conservato a Beta -barrel.
Questo lavoro ha come obiettivo il chiarimento di alcuni meccanismi di dimerizzazione della Beta -LG, infatti essa si presenta sottoforma di dimero a pH fisiologico e in forma monomerica a pH 2.
Dalle informazioni ricavate dalla letteratura risultano implicate nella interazione tra i due monomeri i seguenti fattori :

- L'associazione tra i filamenti in posizione C-terminale di due proteine. Questa interazione gioca un ruolo importante nel posizionamento reciproco tra i due monomeri
- La formazione di interazioni elettrostatiche tra i loops, detti AB, di due proteine. Tali strutture si trovano sulla superficie, al loro interno assumono particolare importanza i ponti salini che si formano tra Arg40 e Asp33 e rispettivamente Asp33 e Arg40 di un'altra proteina.
- L'intervento di interazioni idrofobiche tra alcuni residui nei loops AB che permettono un ulteriore stabilizzazione.

Le interazioni descritte riguardano solo il 6 % dell’intera superficie del monomero, da questa osservazione e da risultati sperimentali si può affermare che il valore della costante di associazione si trova ai limiti inferiori del range di definizione di associazione stabile.
Questo lavoro di ricerca si concentra sul ruolo delle interazioni idrofobiche tra i loops AB di due proteine . Nelle vicinanze dei residui Arg40 e Glu33 infatti ci sono una serie di residui apolari che potrebbero formare una superficie non carica all’interfaccia di dimerizzazione.
Nel tentativo di verificare questa ipotesi il residuo in posizione 35 (Gln) è stato sostituito in un mutante con Glu per introdurre una carica negativa e in un altro mutante con Lys per introdurre una carica positiva e generare in entrambi i modi una repulsione che dovrebbe risultare in una destabilizzazione della forma dimerica.

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3 Sommario La possibilità di sostituire uno o più aminoacidi di una proteina permette di affrontare lo studio dei meccanismi molecolari che regolano le interazioni intra e intermolecolari e quindi i meccanismi di folding, di legame dei substrati e ligandi, di interazioni proteina-proteina. In questo lavoro sperimentale la mutagenesi sito-diretta è stata utilizzata per acquisire nuove conoscenze sulle relazioni struttura-funzione nella β-lattoglobulina bovina. La β-lattoglobulina bovina (β-LG) è una proteina di 18 kDa presente nel latte di alcuni mammiferi ed appartiene alla superfamiglia delle lipocaline. Le proteine appartenenti a questa superfamiglia svolgono una notevole varietà di funzioni biologiche, hanno sequenze scarsamente conservate, ma mostrano un fold conservato a β-barrel. Questo lavoro ha come obiettivo il chiarimento di alcuni meccanismi di dimerizzazione della β-LG, infatti essa si presenta sottoforma di dimero a pH fisiologico e in forma monomerica a pH 2. Dalle informazioni ricavate dalla letteratura risultano implicate nella interazione tra i due monomeri i seguenti fattori : - L'associazione tra i filamenti in posizione C-terminale di due proteine. Questa interazione gioca un ruolo importante nel posizionamento reciproco tra i due monomeri - La formazione di interazioni elettrostatiche tra i loops, detti AB, di due proteine. Tali strutture si trovano sulla superficie, al loro interno assumono particolare importanza i ponti salini che si formano tra Arg40 e Asp33 e rispettivamente Asp33 e Arg40 di un'altra proteina. - L'intervento di interazioni idrofobiche tra alcuni residui nei loops AB che permettono un ulteriore stabilizzazione. Le interazioni descritte riguardano solo il 6 % dell’intera superficie del monomero, da questa osservazione e da risultati sperimentali si può affermare che il valore della costante di associazione si trova ai limiti inferiori del range di definizione di associazione stabile. Questo lavoro di ricerca si concentra sul ruolo delle interazioni idrofobiche tra i loops AB di due proteine . Nelle vicinanze dei residui Arg40 e Glu33 infatti ci sono una serie di residui apolari che potrebbero formare una superficie non carica all’interfaccia di dimerizzazione. Nel tentativo di verificare questa ipotesi il residuo in posizione 35 (Gln) è stato sostituito in un mutante con Glu per introdurre una carica negativa e in un altro mutante con Lys per introdurre una carica positiva e generare in entrambi i modi una repulsione che dovrebbe risultare in una destabilizzazione della forma dimerica.

Laurea liv.I

Facoltà: Scienze Biotecnologiche

Autore: Alberto Bresciani Contatta »

Composta da 30 pagine.

 

Questa tesi ha raggiunto 954 click dal 13/10/2009.

Disponibile in PDF, la consultazione è esclusivamente in formato digitale.