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Studio EPR dell'effetto del congelamento sull'eterogeneità strutturale di metallo-proteine

La spettroscopia di Risonanza Paramagnetica Elettronica (EPR) è stata usata per indagare gli effetti indotti dalla velocità di congelamento e dalle proprietà chimico-fisiche del solvente sull'eterogeneità strutturale di due Blue Copper Proteins: l'azurina, sia nella forma nativa sia nella forma mancante del ponte disolfuro, Cys3Ala/Cys26Ala, ottenuta tramite mutagenesi sito-specifica, e l'amicianina. Usando metodi di simulazione al computer, le caratteristiche spettrali di queste proteine sono state descritte in termini di distribuzioni gaussiane dei principali parametri dell'Hamiltoniana di spin: i tensori g ed A. I risultati mostrano che la velocità di congelamento e la composizione del solvente influiscono sull'eterogeneità strutturale delle due proteine, quantificata dalle deviazioni standard di g ed A. In particolare, entrambi questi parametri si riducono dopo un ciclo di slow cooling; una tale riduzione è più significativa quando si aggiunge del glicerolo alle soluzioni proteiche. Il confronto tra le proteine al rame investigate mette in luce che la riduzione delle due deviazioni standard è più pronunciata nelle azurine rispetto all'amicianina e che il mutante dell'azurina, Cys3Ala/Cys26Ala ha un'eterogeneità strutturale più bassa di quella mostrata dalla proteina nativa. La notevole somiglianza nella sfera di coordinazione del rame delle proteine suggerisce una struttura più rigida della matrice proteica dell'azurina in assenza del ponte disolfuro confrontata con l'azurina nativa e dell'amicianina rispetto ad entrambe le forme di azurina.

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Introduzione 1 INTRODUZIONE Le proteine sono macromolecole, con una ben definita struttura tridimensionale, che svolgono un’ampia varietà di funzioni biologicamente importanti. La loro struttura nativa è determinata dal delicato equilibrio tra le interazioni intra e intermolecolari tra i diversi residui e tra questi e le molecole d’acqua che circondano la proteina. È stato mostrato che la compattezza di questa struttura è favorita dalla presenza dei ponti disolfuro, dal momento che l’eliminazione di uno o più di questi ponti si traduce in una riduzione della stabilità dello stato nativo a favore di quello denaturato (White, 1982; Inaka et al., 1991; Cooper et al., 1992). Ciò spiega perché negli ultimi tempi si sia dato molto spazio all’analisi del ruolo dei ponti disolfuro sulla stabilità del folding delle proteine. Le proteine sono sistemi altamente complessi e, a causa del loro caratteristico disordine strutturale, possono ripiegarsi in diversi modi. Ciò trova riscontro nell’esistenza dei sottostati conformazionali (CS). Il numero dei CS dipende dalla temperatura e dalle caratteristiche chimico-fisiche del solvente in cui le proteine si trovano. Le fluttuazioni tra di essi sono importanti per il funzionamento delle biomolecole (Frauenfelder et al., 1988). Nell’attivazione delle fluttuazioni l’interazione dinamica proteina-solvente gioca un ruolo di primo piano. In particolare, si ritiene che il moto conformazionale sia accoppiato alla dinamica dell’acqua d’idratazione (Doster et al., 1986). Abbassando la temperatura al di sotto dei 200 K, le molecole di proteina sono bloccate in una particolare conformazione e danno luogo ad una distribuzione statica dei sottostati (Frauenfelder, 1987). L’applicazione della spettroscopia di Risonanza Paramagnetica Elettronica (EPR) allo studio delle metallo-proteine ha notevolmente contribuito alla comprensione dell’eterogeneità strutturale delle proteine a bassa temperatura (Brill, 1977; Hagen, 1981; Brill et al., 1986; Groeneveld et al., 1987; Cannistraro, 1990; Aqualino et al., 1991; Guzzi et al., 1997). Con il supporto di simulazioni al computer, basate su opportuni modelli teorici, le caratteristiche spettrali vengono interpretate in termini di una distribuzione del campo elettrico generato dai ligandi intorno allo ione metallico paramagnetico (Hagen, 1981; Brill et al., 1986; Bizzarri & Cannistraro, 1991).

Tesi di Laurea

Facoltà: Scienze Matematiche, Fisiche e Naturali

Autore: Andrea Stirpe Contatta »

Composta da 127 pagine.

 

Questa tesi ha raggiunto 1709 click dal 20/03/2004.

Disponibile in PDF, la consultazione è esclusivamente in formato digitale.