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Ottimizzazione della biodisponibilità orale di un nuovo composto antitumorale mediante approccio “PRO-DRUG”, studi di farmacocinetica nel topo e supporto UHPLC/MS/MS

Informazioni tesi

  Autore: Marco Guanci
  Tipo: Laurea liv.I
  Anno: 2009-10
  Università: Università degli Studi di Urbino
  Facoltà: Scienze e Tecnologie
  Corso: Analisi Chimico-Biologiche
  Relatore: Paolino Ninfali
  Lingua: Italiano
  Num. pagine: 60

Il lavoro descritto in questa tesi ha affrontato uno dei temi di maggior interesse per le aziende o gli enti che si occupano di “Drug Discovery”: la biodisponibilità orale dei farmaci. E’ indiscutibile infatti che per un paziente, poter assumere un farmaco per via orale, sia assolutamente più comodo che per via endovenosa, soprattutto se sono previste somministrazioni frequenti come capita spesso per i farmaci oncologici. Questa considerazione crea inevitabilmente maggior interesse da parte del mercato verso farmaci orali rispetto a quelli sistemici, indirizzando in tal senso gli obiettivi della ricerca. Nel caso specifico descritto in questa tesi, il composto preso in esame (NMS-E973) ha ottime caratteristiche di efficacia ma dimostra bassi valori di biodisponibilità orale. Per tale motivo si è deciso di esplorare possibili miglioramenti in tal senso mediante la sintesi di profarmaci atti a migliorare l’assorbimento della molecola oltre che a proteggerla dal metabolismo epatico di coniugazione. Prima di procedere con gli esperimenti di farmacocinetica nel topo, si è preferito effettuare alcune verifiche di stabilità in vitro che sono state molto utili per valutare preliminarmente le caratteristiche dei profarmaci sintetizzati in modo da non portare agli esperimenti in vivo composti che presentassero proprietà chimico-fisiche non adatte. Risulta infatti indispensabile che un candidato profarmaco abbia le seguenti caratteristiche:
- sia chimicamente stabile al pH dello stomaco (pH ≈ 1.5), in modo da poter attraversare senza problemi il tratto gastrico;
- sia chimicamente stabile al pH di plasma ed intestino (pH ≈ 7.4) in modo da poter essere assorbito come tale nel flusso ematico;
- liberi il relativo farmaco per azione degli enzimi specifici in modo che questo possa raggiungere i tessuti bersaglio e svolgere la propria azione.
Tutti i profarmaci sono risultati stabili a pH 1.5 e pH 7.4, tranne il composto NMS-PRO4 che ha dimostrato di essere chimicamente instabile a pH 7.4 ed è stato quindi scartato. La prova di rilascio del relativo farmaco in plasma, invece, ha evidenziato una cinetica ottimale per i due esteri (NMS-PRO1 e NMS-PRO2) mentre gli altri composti hanno evidenziato un’idrolisi totale del profarmaco già dopo pochi secondi, caratteristica che li rende meno interessanti per la successiva prova in vivo. Il NMS-PRO3 è risultato invece instabile nel plasma, ma la degradazione del profarmaco non ha generato NMS-E973, è plausibile quindi che tale degradazione non sia dovuta all’idrolisi enzimatica dei gruppi vettore. Si è deciso quindi di testare in vivo solo i profarmaci esterei poiché hanno dimostrato di soddisfare a pieno i criteri di accettabilità sopra elencati, ma i dati sperimentali degli esperimenti in vivo hanno dimostrato chiaramente che i due profarmaci testati non hanno migliorato la biodisponibilità orale del NMS-E973. La presenza dei gruppi vettori a protezione degli ossidrili del resorcinolo ha come scopo quello di evitare il metabolismo presistemico ad opera degli enzimi intestinali ed il metabolismo epatico di fase II.
L’assenza di biodisponibilità orale dei due profarmaci sembra quindi essere imputabile al fallimento di uno o di entrambe questi obiettivi. Infatti se il profarmaco subisse l’idrolisi dei gruppi vettori già nell’intestino, il NMS-E973 potrebbe non essere assorbito a livello intestinale, oppure, se venisse assorbito privo dei gruppi vettore, verrebbe facilmente metabolizzato a livello epatico tramite reazione di glucoronidazione e successivamente eliminato. L’approccio pro-drug è stato quindi abbandonato in favore di ulteriore lavoro di chimica medicinale su questa classe di composti. L’obiettivo sarà quindi quello di ottenere molecole con caratteristiche chimico-fisiche tali da poter essere facilmente assorbite a livello intestinale ed eventualmente poter evitare l’azione catalitica degli enzimi epatici addetti alle reazioni di glucoronidazione. Dal punto di vista sperimentale è importante sottolineare l’importanza delle tecniche analitiche utilizzate. L’UHPLC è infatti una tecnica che ormai da circa dieci anni ha portato un notevole contributo alla chimica analitica. Essa infatti permette di eseguire analisi cromatografiche ad altissima risoluzione in tempi ridottissimi, con significativi risparmi in termini di tempo e di costi. La spettrometria di massa, dal canto suo, rimane ad oggi la tecnica analitica con maggior selettività e sensibilità, due caratteristiche che la rendono la tecnica d’elezione per l’analisi quantitativa, in particolar modo di campioni biologici.
Queste considerazioni tecniche risultano molto importanti ai fini di una valutazione più generale del processo di “Drug Discovery” in quanto la disponibilità di strumentazione all’avanguardia permette, come in questo caso, che approcci sperimentali e scelte strategiche possano essere valutate in tempi brevi e con costi contenuti, a completo beneficio dell’intero processo di ricerca.

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2 1 INTRODUZIONE 1.1 Le strategie di drug discovery Quando si parla di drug discovery si intende un processo complesso frutto dalla sinergia di tre branche che hanno subito una importante evoluzione a partire dagli anni ’90: chimica, biologia molecolare e automazione. La chimica ha introdotto metodi innovativi di produzione di nuove classi di composti organici, e tra questi l’approccio combinatoriale è sicuramente quello di maggior interesse. Il risultato è stata l’incrementata capacità di esplorazione del cosiddetto “chemistry space”, che descrive la relazione multidimensionale tra struttura molecolare e attività biologica dei composti. Inoltre sono stati introdotti nuovi strumenti cognitivi nell’ambito della chimica strutturale come gli studi in silico di docking molecolare, la mappatura dei siti di binding via NMR (SAR-by- NMR) e gli studi di homology-modeling, che consentono un rational design nel processo di sintesi di potenziali farmaci. Dall’altra parte la biologia molecolare e le derivanti genomica e proteomica hanno consentito l’identificazione di nuovi importanti target biologici e la conseguente espressione di tali target in sistemi cellulari al fine di operare nuovi saggi in vitro. Di supporto a queste due grandi branche è stata ed è tutt’ora l’automazione. In particolare i progressi nell’ambito della miniaturizzazione, della velocità e nell’accuratezza di esecuzione hanno consentito la nascita delle tecniche high- throughput e ultrahigh-throughput. L’impatto di questo rapporto multidisciplinare ha incrementato notevolmente la capacità di creare composti farmacologicamente interessanti. Ciò ha comportato l’instaurarsi di una qual certa asimmetria di sviluppo, poiché mentre da un lato la progettazione (Drug design) e la sintesi di potenziali farmaci è abbastanza rapida, meno diretto e immediato è il passaggio seguente volto all’identificazione degli Hit compound da convertire in Lead compound (Lead identification) e da ottimizzare (Lead optimization). Praticamente tutto ciò si traduce in un esteso sforzo analitico volto a identificare quale tra gli n composti sintetizzati attivi in vitro possiedono le caratteristiche di un buon farmaco, al fine di incrementare la probabilità che questo abbia successo nella successiva fase clinica sino ad arrivare poi alla sua commercializzazione. Le caratteristiche che un composto deve possedere per essere un buon drug candidate sono riconducibili a queste cinque principali: Efficacia: La capacità del composto di produrre l’effetto farmacologico desiderato (intendendo sia la quantità di composto necessaria per ottenere l’effetto, sia la portata della risposta). Biodisponibilità: La percentuale della dose somministrata che effettivamente entra nella circolazione sistemica ed è in grado di distribuirsi in tutto l’organismo. Tale parametro sottintende alla capacità del composto somministrato di penetrare nel sito di somministrazione rendendosi così disponibile al raggiungimento del target. Persistenza: La capacità del composto di risiedere presso il sito di legame col target per un tempo sufficiente a generare un effetto farmacologico rilevante. Tale caratteristica trova traduzione nell’Emivita del composto nel plasma.

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Parole chiave

biodisponibilità
farmacocinetica
lc/ms/ms
metabolismo
prodrug
spettrometria di massa
uhplc
uplc
uplc/ms/ms

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