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Dosaggio di Endocannabinoidi Plasmatici mediante Cromatografia Liquida abbinata a Spettrometria di Massa Tandem (LC-MS/MS): confronto fra una popolazione normale e una popolazione affetta da obesità

Informazioni tesi

  Autore: Filippo Betti
  Tipo: Laurea liv.II (specialistica)
  Anno: 2009-10
  Università: Università degli Studi di Bologna
  Facoltà: Medicina e Chirurgia
  Corso: Biotecnologie mediche, veterinarie e farmaceutiche
  Relatore: Uberto Pagotto
  Lingua: Italiano
  Num. pagine: 128

L’innovazione della LC-MS/MS è rappresentato dall’aver unito la versatilità della cromatografia liquida con l’elevata sensibilità e specificità dello spettrometro di massa a triplo quadrupolo. Per accoppiare questi due strumenti si è dovuto principalmente risolvere il grosso problema nell’interfacciarli poiché è necessario rimuovere il solvente (le fasi mobili) in cui è disciolto il campione prima che quest’ultimo giunga allo spettrometro. La cromatografia liquida infatti lavora con grandi volumi di solvente ad alta pressione, mentre il sistema spettrometrico lavora in alto vuoto: quindi a questo livello il campione deve essere necessariamente in forma gassosa per poter accedere all’interno dello spettrometro ed essere attratto dal campo elettrico e dal gradiente pressorio. Ciò è stato reso possibile dall’invenzione di John Fenn, l’interfaccia ESI (ionizzazione a pressione atmosferica), che nel 2002 gli permise di ottenere il premio nobel.
Con questa tecnica non ci sono limiti né per la grandezza degli analiti da studiare, né per le loro caratteristiche chimiche; è una tecnica multianalitica e fornisce risultati in breve tempo, generando un’alta produttività.
Fino a poco tempo fa, in campo endocrinologico, per quanto riguarda le analisi di laboratorio, era possibile quantificare gli ormoni solamente grazie a metodiche immunologiche, la cui limitazione principale è la specificità. Successivamente si è evoluta la GC-MS, la cui specificità è molto più alta rispetto alle metodiche immunologiche. Con essa è stato possibile sviluppare diversi metodi di quantificazione, soprattutto nel caso degli steroidi e degli ormoni tiroidei, tuttavia la preparazione dei campioni risulta spesso laboriosa, come precedentemente detto. L’avvento della LC-MS/MS ha facilitato o permesso l’analisi di un’ampia gamma di molecole, da quelle sugli steroidi a quelle sulle catecolamine, grazie alla sua facilità e versatilità d’uso. Tutto ciò sia in ambito di ricerca, sia in campo diagnostico, dove questa tecnica permette di ottenere risultati migliori grazie alla sua maggiore specificità e sensibilità. Questo vale soprattutto per le analisi di ormoni steroidei, tiroidei e altri ormoni correlati, come la 25-idrossi-vitamina D3. Vale meno nel caso degli ormoni proteici, la cui generalmente bassissima concentrazione e variabilità, dovuta a polimorfismi o mutazioni, rende difficile la quantificazione. Sono invece più proponibili analisi di quantificazione su ormoni peptidici, data la loro minore possibilità di variare (Cabaleiro et al.2006; Rogatsky et al. 2006).
Per quanto riguarda la ricerca sul sistema endocannabinoide, prima dell’avvento della tecnica LC-MS/MS, le analisi quantitative venivano svolte con altre tecniche, quali la GC/MS (H.Y.T. Yang et al. 1999), che richiedeva, in quel caso, almeno due passaggi di derivatizzazione.
Con lo sviluppo della tecnica LC-MS/MS, accelerato anche dalla forte necessità di studiare il coinvolgimento del sistema endocannabinoide nell’obesità, sono stati sviluppati diversi tipi di metodi per l’analisi degli endocannabinoidi, alcuni in grado di separarne e quantificarne cinque (A. Thomas et al. 2008), altri capaci di analizzare fino a dodici endocannabinoidi nello stesso campione (Balvers et al. 2009)
Del resto questa tecnica è l’unica al momento in grado di permettere una misurazione efficiente degli endocannabinoidi, in quanto gode della sensibilità e specificità indispensabili per la quantificazione di questi lipidi instabili in matrici quali plasma, liquor o tessuti, dove sono presenti in concentrazioni molto basse. L’interesse per queste molecole è centrato in buona parte sui recenti studi che hanno correlato un aumento degli endocannabinoidi circolanti e tissutali (ad esempio ipotalamo e tessuto adiposo) con l’obesità, ma sono necessari studi con un numero di soggetti statisticamente rilevante, finora non svolti.

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7 1 LA CROMATOGRAFIA La cromatografia nacque come tecnica separativa, e si è evoluta in seguito come tecnica analitica. I due tipi principali di cromatografia sono quella liquida e quella gassosa. La cromatografia si basa sulla capacità dei vari componenti di una miscela di ripartirsi fra due fasi, in base alle proprie caratteristiche chimico-fisiche (vedi Fig. 1.1). Fig. 1.1 Principio della ripartizione fra due fasi Queste ultime conferiscono agli analiti una diversa affinità per le due fasi, una stazionaria e una mobile, che differiscono in base al tipo di cromatografia: - in cromatografia liquida, la fase stazionaria è solida e la fase mobile è liquida; - in cromatografia gassosa, la fase stazionaria è solida o liquida e la fase mobile è gassosa. La fase stazionaria è sempre immobilizzata su un supporto, diverso in base al tipo di cromatografia. La cromatografia fu inventata da Michail Cvet nel 1906, per separare dei composti vegetali, utilizzando una colonna di vetro per contenere la fase stazionaria. Il campione, durante questo trattamento, si è separato in bande di colore diverso, ognuna delle quali attraversava la fase stazionaria con una velocità diversa. Data la presenza di bande colorate, la tecnica venne denominata cromatografia. In questo modo, Cvet riuscì ad ottenere un sistema di frazionamento efficiente, gettando così le basi per la moderna cromatografia. Attualmente per cromatografia si intendono tutte le tecniche di separazione che sfruttano il principio della ripartizione tra due fasi. Fase Mobile Fase Stazionaria

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Parole chiave

1,2 dag: 1,2 diacilglicerolo
1-ag: 1-arachidonoil glicerolo
2ag: 2-arachidonoil glicerolo
aea: anandamide
apci: ionizzazione chimica a pressione atmosferica
api: ionizzazione a pressione atmosferica
cb 1: recettore di tipo 1 dei cannabinoidi
cromatografia liquida
dgl: diacilglicerolo lipasi
ep: entrance potencial
esi: ionizzazione elettrospray
faah: amide idrossilasi degli acidi grassi
hplc: cromatografia liquida ad alta efficienza
is: standard interno
lc/ms/ms
linac: acceleratore lineare
lloq: limite inferiore di quantificazione
lod: limite di rivelabilità
mrm: monitoraggio di reazioni multiple
oea: oleil-etanolamide
pea: palmitoil-etanolamide
s/n: rapporto fra segnale e rumore di fondo
spe: estrazione in fase solida
spettrometria di massa tandem

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