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Messa a punto di metodi diagnostici in real time PCR per malattie delle piante da Oomiceti del genere Phytophthora

Organismi del genere Phytophthora, presenti in habitat terrestri e acquatici, sono noti per essere i principali patogeni che vanno a colpire le radici deputate all’assorbimento delle sostanze nutritive e responsabili di marciumi del colletto di numerose piante (Moralejo et al., 2009).
Tra gli strumenti diagnostici sviluppati in patologia vegetale, la real-time PCR è risultata essere un metodo efficace in grado di rilevare e quantificare le specie di Phytophthora in ambienti diversi.
In questa tesi è stata messa a punto una metodica in real time PCR, utilizzando la chimica SYBR Green, per rilevare e quantificare alcune specie di Phytophthora in diverse matrici (tessuti vegetali, suolo ed acqua) ed in diversi ambiti: P. cactorum e cinnamomi in ambiente vivaistico; P. cambivora in bosco su piante di castagno; Phytophthora spp. su ippocastano in ambito urbano.
Sono stati raccolti campioni di corteccia da piante di castagno sintomatiche (Castanea sativa) infette da P. cambivora e da piante di ippocastano con sintomi provocati da Phytophthora spp. e campioni di suolo in castagneto. In laboratorio sono stati preparati campioni di terreno sterilizzato inoculati con P. cambivora, campioni di acqua sterilizzata inoculati con P. cinnamomi e P. cactorum e piantine di Vicia faba inoculate con P. cinnamomi e P. cactorum.
Il DNA è stato estratto da micelio fungino, materiale vegetale e acqua come descritto da Luchi et al. (2005). Il DNA dai campioni di suolo è stato estratto utilizzando FastDNA SPIN Kit for Soil (MP Biomedicals) seguendo le istruzioni del produttore.
La metodica in real time PCR è stata sviluppata utilizzando dei primers descritti da Schena et al. (2008). Primer specifici sono stati utilizzati per rilevare P. cambivora, mentre le altre specie sono state rilevate utilizzando primers generici. La loro specificità è stata dapprima testata su DNA estratto da colture pure di Phytophthora spp. e Pythium.
Utilizzando primers specifici con la real time PCR, è stato possibile rilevare la presenza di P. cambivora nei tessuti di castagno e nel suolo inoculato con P. cambivora. Il DNA di P. cambivora è stato rilevato nei campioni di corteccia dopo una nested PCR. Mentre dai campioni di suolo presi in castagneto non è risultata la presenza di P. cambivora.
La sensibilità del metodo durante la fase iniziale della colonizzazione è stata evidenziata rilevando il DNA di P. cinnamomi e P. cactorum in semenzali di fava dopo 3, 5 e 10 dall'inoculazione. Il DNA dei patogeni è stato quantificato e varia da 103 a 104 pg/g. E 'stato anche possibile rilevare la presenza e quantificare il DNA di P. cactorum e P. cinnamomi in acqua (102 pg/g e 103 pg/g rispettivamente). Mentre dai tessuti di ippocastano non è stata rilevata la presenza di Phytophthora spp.
La sensibilità e la specificità della real time PCR sono state confermate anche in piante infette, acqua e suolo, mostrando la sua capacità di rilevare piccole quantità di DNA di Phytophthora da differenti campioni.

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1. INTRODUZIONE Gli oomiceti (Oomycota, sinonimo Oomycetes) sono una classe di microrganismi appartenenti al regno dei Cromisti. Questo gruppo, è stato di recente separato da quello dei funghi ai quali somiglia per avere un micelio con sviluppo filamentoso. Gli oomiceti si caratterizzano per la presenza di cellule mobili fornite di ciglia, utili durante la fase di diffusione; inoltre la parete cellulare è costituita da una miscela di composti cellulosici e glucani (non chitina, come nei funghi). I nuclei all'interno dei filamenti sono diploidi, con due insiemi di informazioni genetiche, non aploidi come nei funghi. Le loro strutture riproduttive sono costituite da anteridi e oogoni. Agli Oomiceti, che nella letteratura inglese vengono citati come organismi “fungus- like” o “water moulds” “funghi d’acqua", appartiene la famiglia delle Pythiaceae con due generi, molto importanti nel campo fitopatologico: Pythium e Phytophthora. Negli Oomiceti la riproduzione asessuata avviene tramite zoospore mobili, biflagellate che vengono formate all’interno di un “sacco” detto “zoosporangio” portato da un’ifa sporangiofora. A maturità, una piccola apertura si forma sulla parete e le zoospore vengono rilasciate nell’ambiente dove sono capaci di diffondersi muovendosi nell’acqua. In alcune specie si formano delle strutture vegetative a parete spessa dette “clamidospore", che permettono la conservazione e il mantenimento dell’organismo quando le condizioni ambientali sono sfavorevoli. La riproduzione sessuata avviene a seguito della fusione della struttura maschile (anteridio) con quella femminile (oogonio), ben distinte morfologicamente. A differenza dei veri funghi, solamente i nuclei dei due gameti maturi sono aploidi, mentre il micelio e le zoospore sono diploidi. Gli oogoni fertilizzati maturano e danno luogo alle “oospore” organi preposti alla conservazione e alla infezione. I due gameti possono essere portati e formarsi da un solo e singolo micelio ("tallo", in tal caso omotallico), o da due differenti miceli (eterotallico). Il ciclo biologico di questi organismi è legato all’acqua, che rappresenta il principale vettore di diffusione della malattia. Hanno micelio cenocitico con pochi o nessun setto e in acqua producono zoosporangi che portano zoospore biflagellate. Le oospore, che si formano singolarmente all’interno dell’oogonio dopo che è stato fecondato dall’anteridio, permettono al patogeno di conservarsi nel terreno anche per molti anni. Altre strutture di conservazione sono le clamidospore. Attualmente, le specie di Phytophthora riconosciute sono oltre 70. La maggior parte di esse hanno habitat terricolo e numerose tra quelle descritte recentemente sono state

Laurea liv.II (specialistica)

Facoltà: Agraria

Autore: Valeria Mancini Contatta »

Composta da 82 pagine.

 

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Disponibile in PDF, la consultazione è esclusivamente in formato digitale.