p73 e p63 sostengono una corretta progressione del ciclo cellulare attraverso l’attivazione trascrizionale di geni G1/S

Obiettivo della tesi è stato studiare l’attività di transattivazione dei membri della famiglia genica di p53 ed in particolare l’identificazione di nuovi geni target trascrizionali.
Nel primo periodo di dottorato, tale ricerca è stata condotta genome-wide combinando una ricerca in silico dei p53 responsive element (p53RE) su tutto il genoma umano, utilizzando gli algoritmi Patsearch Matcher e DNAfan, sviluppati dal nostro gruppo di bioinformatica (Grillo et al. 2003; Gisel et al. 2004) e un approccio di microarray, ibridizzando RNA estratto da linee cellulari isogeniche di rene embrionale umano 293 T-rex trasfettate stabilmente e overesprimenti alcune delle isoforme della famiglia genica (in particolare p53wt, p53H175, TAp73, TAp73, TAp63e Np63, confrontandone i profili di espressione rispetto a una linea cellulare di controllo (293 T-rex CAT).
I dati provenienti dall’analisi in silico e dagli esperimenti di microarray sono stati integrati in un database specializzato disponibile in rete e chiamato p53FamTAG database (Sbisà et al. 2007).
Tra i geni, analizzati in silico, che presentavano almeno una p53RE nelle proprie regioni regolatorie, e la cui espressione risultava modulata in seguito agli esperimenti di microarray, abbiamo osservato che c’erano diversi geni coinvolti nella progressione del ciclo cellulare.
Abbiamo così ipotizzato che p63 e p73 potessero avere un ruolo in una corretta progressione del ciclo cellulare, attraverso la transattivazione di geni target, che rivestono un ruolo importante in fase S.
Come si è detto nell’introduzione, molti studi sono stati condotti sul ruolo dei membri della famiglia genica di p53 in seguito a una loro overespressione e a una condizione di stress cellulare, mentre al contrario molto poco si conosce sulla loro eventuale funzione in una corretta progressione del ciclo cellulare.
A tale scopo abbiamo condotto prima uno studio pilota sul ruolo della p63 nella proliferazione cellulare, attraverso la transattivazione di geni target coinvolti nella crescita cellulare quale il gene dell’Adenosina Deaminasi (ADA), che codifica per un importante enzima coinvolto nella sintesi e nel riparo del DNA, e che in un lavoro precedente del nostro laboratorio si era già visto essere indotto dalla p73, ma non da p53 (Tullo et al., 2003)
ADA è risultato essere un target diretto di p63, confermando il coinvolgimento integrato di questi due geni nella proliferazione cellulare (Sbisà et al., 2006).
Successivamente, lo studio è stato esteso a un gruppo più numeroso di geni coinvolti nella progressione del ciclo cellulare e la cui espressione risultava modulata durante le varie fasi del ciclo cellulare, in particolare, con un picco di espressione in fase S.
Tra i geni selezionati, l’attenzione è ricaduta,olte che sull’Adenosina Deaminasi (ADA), un’enzima coinvolto nel metabolismo delle purine; sulla Ciclina D3 (CCND3), subunità regolatrice delle cdk-chinasi; sulla Polimerasi 2 (POLD2), coinvolta nella sintesi e riparo del DNA; sulla chinasi ciclina-dipendente CDC2 (cell division cycle 2), una subunità catalitica del complesso MPF (fattore che promuove la mitosi), che è essenziale per la transizione G2M; sulla subunità C della Fosfatasi CDC25 (cell division cycle 25c - CDC25c), una tirosin-fosfatasi che attiva CDC2 permettendo la progressione del ciclo cellulare; sulla sintasi degli acidi grassi (FASN), un’enzima chiave coinvolto nella biogenesi dei lipidi di membrana in cellule proliferanti.
Quindi, l’approccio è stato quello di valutare la capacità delle sequenze target per la famiglia genica di p53 (p53REs), individuate nelle regioni regolatorie dei geni ADA, FASN, CCND3, POLD2, CDC2 e CDC25c, di essere legate dalle proteine della famiglia genica di p53, in particolare p63 e p73, e di funzionare da promotori, enhancer o silencer.
E’stato quindi verificato se tali geni potessero essere target funzionali diretti di p73 e p63 e, se la regolazione trascrizionale da parte di queste proteine avvenisse principalmente durante la fase S.