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Analisi cinetica e spettroscopica di glutammato decarbossilasi 1 da Arabidopsis thaliana

Informazioni tesi

  Autore: Virginia Carpi
  Tipo: Laurea liv.II (specialistica)
  Anno: 2006-07
  Università: Università degli Studi di Verona
  Facoltà: Scienze Matematiche, Fisiche e Naturali
  Corso: Biotecnologie agrarie
  Relatore: Paola Dominici
  Lingua: Italiano
  Num. pagine: 90

Il metabolismo degli aminoacidi si basa sull’attività di una famiglia di enzimi dipendenti dal piridossal-5'-fosfato, molecola estremamente versatile, che permette loro di catalizzare decarbossilazioni, transaminazioni, racemizzazioni, deaminazioni e scissioni aldoliche, scindendo uno dei tre legami al carbonio a di un substrato aminoacidico.
Le glutammato decarbossilasi (GAD) fanno parte di questa famiglia enzimatica e catalizzano l’a-decarbossilazione dell’acido glutammico ad acido g-amminobutirrico (GABA). Sono enzimi ampiamente distribuiti nei procarioti ed eucarioti ma, solo le GAD di pianta presentano un dominio di legame Ca2+/Calmodulina (CaM) dipendente situato nella regione C-terminale.
In Arabidopsis thaliana sono state identificate cinque isoforme di GAD, ma di queste solo due sono state caratterizzate, la GAD1 e la GAD2, che presentano le maggiori differenze di sequenza proprio nella regione Cterminale.
L’obiettivo di questa tesi di Laurea è la caratterizzazione dell’isoforma 1 di glutammato decarbossilasi da Arabidopsis thaliana mediante analisi spettroscopiche (di assorbimento e di fluorescenza), cinetiche e mediante lo studio dell’interazione dell’enzima con un analogo del substrato, L-glutammato metil estere.
Lo spettro d’assorbimento di GAD1 è caratterizzato da due massimi a ~340 e ~420 nm, corrispondenti alla forma cataliticamente inattiva e attiva dell’aldimina interna, rispettivamente. Dagli spettri di assorbimento si osserva che in presenza di CaM, ad ogni valore di pH, si ha prevalenza della banda a ~420 nm corrispondente alla forma chetoenaminica cataliticamente attiva. L’assegnazione della specie che assorbe a ~340 nm invece è meno diretta in quanto diverse strutture hanno massimo di assorbimento a questa lunghezza d’onda. Tra le potenziali strutture per la specie a ~340 nm vi sono l’enolimina, l’aldamina sostituita e la forma aldiminica in cui l’azoto piridinico è deprotonato. Per discriminare quali tra queste sia associata alla banda a 340 nm è stata utilizzata la spettroscopia di fluorescenza che ha dato dei risultati consistenti con la presenza di un’aldamina sostituita. In particolare, mediante analisi di mutagenesi sito-specifica è emerso che due residui di Lisina, situati sull’estremità C-terminale dell’enzima in posizione 496 e 497, potrebbero essere responsabili della formazione dell’aldamina sostituita a pH alcalino. Gli studi cinetici hanno invece permesso di comprendere l’andamento in funzione del pH dei parametri Kcat, che definisce la capacità del complesso enzima-substrato di dare il prodotto in condizioni saturanti di substrato, e Kcat/Km, che indica invece la velocità di conversione del complesso enzima-substrato in enzima-prodotto, permettendo così di ricavare i valori di pK dei gruppi coinvolti nella catalisi.
Lo studio cinetico e spettroscopico dell’interazione dell’enzima con Lglutammato metil estere, ha permesso di definire il tipo di inibizione esercitato da tale molecola, nonche’ di individuare spettroscopicamente gli intermedi di reazione, quali l’aldimina esterna deprotonata, e capire mediante analisi proteolitica e cromatografia in gel filtrazione, come questo ligando influenzi la conformazione dell’enzima.

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Introduzione 4 Il Piridossal-5’- fosfato ed il suo ruolo nella catalisi Sin dagli inizi della moderna enzimologia gli enzimi piridossal-5’- fosfato (PLP) dipendenti hanno sempre attirato l’interesse di molti biochimici. Grazie ai recenti sviluppi nel campo della cristallografia di proteine, alla considerevole espansione delle banche dati biologiche e allo sviluppo di nuovi strumenti informatici nonché alle metodologie spettroscopiche, la ricerca nel campo degli enzimi PLP-dipendenti ha subìto una nuova accelerazione, cominciando a risolvere quesiti fondamentali di carattere sia funzionale che strutturale che riguardano questi catalizzatori biologici. Attualmente sono disponibili 140 strutture cristallografiche di enzimi PLP-dipendenti, la maggioranza delle quali risolta negli ultimi anni; migliaia sono le sequenze acquisite grazie ai progetti di sequenziamento di interi genomi. Questa ricchezza di informazioni rappresenta un riferimento fondamentale per l’analisi di dati biochimici precedentemente acquisiti e costituisce la base di partenza per intraprendere nuove ricerche. Tra queste possiamo annoverare lo studio del controllo delle specificità di substrato e di reazione, della regolazione dell’attività catalitica, delle relazioni tra attività catalitica e percorso evolutivo, dei meccanismi di folding e lo sviluppo di nuovi farmaci. Una caratteristica chiave emersa dallo studio di tali enzimi è l’enorme versatilità chimica del cofattore in grado di supportare un gran numero di reazioni catalitiche distinte (Fig. 1 e 3). Le sue proprietà di trappola di elettroni (paragrafo 1.1) lo rendono la molecola sicuramente più versatile tra tutti i sistemi catalitici finora studiati e, tali proprietà, sono sfruttate per permettere all’oloenzima di svolgere un elevato numero di reazioni catalitiche differenti: transaminazioni, racemizzazioni, α- decarbossilazioni, scissione aldolica, β- e γ-eliminazione. Tramite un ingegnoso interscambio tra il cofattore e l’organizzazione del sito attivo,

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Parole chiave

calmodulina
cam
glutammato decarbossilasi
piridossal-5’-fosfato
gamma-amminobutirrato
calmodulin binding protein
plp
calmodulin binding domain
l-glutammato metil estere
l-glu-ome
cabd
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