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Valutazione del potenziale probiotico di ceppi di Lactobacillus isolati da Parmigiano-reggiano mediante screening sottrattivo

La popolazione lattica non starter (NSLAB) residente in alimenti fermentati è stata recentemente rivalutata come potenziale risorsa di ceppi probiotici. Nel presente lavoro, è stata analizzata l’attitudine probiotica di un set geneticamente de-replicato di 48 NSLAB (22 Lactobacillus rhamnosus, 18 Lactobacillus paracasei, 4 Lactobacillus casei, 2 Lactobacillus harbinensis e 2 Lactobacillus fermentum) isolati da differenti campioni di Parmigiano Reggiano stagionato. Proprietà tecnologiche (resistenza alle barriere biologiche), di sicurezza (antibiotico resistenza) e funzionali (adesività misurata come auto aggregazione, coaggregazione contro patogeni e idrofobicità) sono state valutate mediante uno screening in vitro sottrattivo. La maggior parte dei ceppi mostra resistenza a sali biliari, lisozima, succo gastrico sintetico e succo pancreatico, mentre nessun ceppo mostra resistenza a pH 2 dopo 6 ore di incubazione. In particolare 35% dei ceppi mostrano una sopravvivenza >40% a 1.5% (w/v) sali biliari coniugati (sodium cholate e sodium deoxycholate) ed una buona tolleranza a succhi gastrici e pancreatici. I tests di suscettibilità contro penicillina, ampicillina, cloramfenicolo, rifampicina, vancomicina, streptomicina e tetraciclina, mostrano che tutti i ceppi sono suscettibili agli antibiotici testati, con l’eccezione della vancomicina e della streptomicina. In particolare, il 77.6% dei ceppi mostra resistenza alla streptomicina, un aminoglicoside battericida che aumenta la mistranslation ribosomale, tuttavia gli stessi ceppi diventano sensibili quando valutati su mezzo contenente 0.5% di sali biliari. I dati suggeriscono che i sali coniugati dell’acido colico e deossicolico potrebbero agire impermeabilizzando la membrana e riducendo l’uptake intracellulare dell’antibiotico. Le proprietà cellulari di superficie, come l’idrofobicità, misurata mediante saggio BATH contro xilene, l’autoaggregazione, e la coaggregazione contro due patogeni alimentari, Escherichia coli e Salmonella enterica var. thyphimurium, sono indice non solo della capacità dei ceppi probiotici di colonizzare il GIT, ma anche di permanere in esso, inibendo la crescita dei patogeni per competizione. I risultati mostrano che: (i) 20 ceppi su 49 hanno una idrofobicità superiore al 50%; (ii) 9 ceppi (4 L. rhamnosus, 3 L. paracasei e 1 L. harbiniensis) mostrano valori molto significativi di autoaggregazione compresi fra il 51 e il 76%; (iii) la maggior parte dei ceppi mostra una ridotta coaggregazione con E. coli e ridottissima con S. thyphimurium. I ceppi con migliori proprietà autoaggreganti mostrano anche coaggregazione con E. coli, suggerendo che la due capacità sono correlate.
Infine per discriminare i lattobacilli inclusi nel presente studio sulla base di tutte le proprietà considerate, è stata effettuata un analisi delle componenti principali (PCA). I risultati hanno mostrato che 3 componenti riescono a spiegare il 53.2% della variabilità, con PC1 (25.2%) principalmente riconducibile alla suscettibilità agli antibiotici; PC2 (14.2%) prevalentemente spiegata dalla suscettibilità ai succhi gastrici e pancreatici; PC3 (13.6%) spiegata dalle proprietà di parete/membrana. Le proiezioni di PC1 verso PC2 e PC1 verso PC3 mostrano che i ceppi non sono raccolti in nuvole ben definite, a dimostrazione della grande variabilità del set di ceppi geneticamente non ridondanti. Tuttavia, nella prima proiezione possiamo evidenziare che i ceppi L. rhamnosus e 1 ceppo L. harbiniensis tendono a disporsi nel quadrante negativo per PC1 e negativo per PC2, indicando una buona performance per le proprietà di resistenza al GIT, mentre quelli L. paracasei nel quadrante positivo per il fattore 1, preferibilmente vicino al valore medio del fattore 2. La seconda proiezione evidenzia la stessa segregazione dei ceppi L. rhamnosus e L. paracasei in gruppi, con i ceppi L. rhamnosus e un ceppo L. harbiniensis con alti valori di auto aggregazione e idrofobicità.
In conclusione, il presente studio ha dimostrato che il Parmigiano Reggiano è un bacino di potenziali probiotici e ha proposto un pool di 3 ceppi (L. rhamnosus, L. harbiniensis e L. casei) con promettente attitudine probiotica per le prove in vivo.

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1 1. INTRODUZIONE E CENNI STORICI Tra i microrganismi coinvolti nella preparazione di alimenti, i batteri lattici (lactic acid bacteria, LAB), sia naturalmente presenti nelle materie prime (non starter LAB, NSLAB), sia addizionati come colture starter e/o protettive (starter LAB, SLAB), trovano largo impiego nella produzione di una grande varietà di alimenti fermentati, come prodotti da forno, insilati, derivati del latte, della carne, e di vegetali, contribuendo alle caratteristiche di qualità dei prodotti finali e la loro stabilità e sicurezza microbiologica. Il riconoscimento da parte di Pasteur nel 1857 della natura microbica delle fermentazioni e successivamente il primo isolamento in coltura pura di un batterio da parte di Lister nel 1878, identificato come Bacterium lactis (oggi Lactococcus lactis), portarono all’impiego, nel 1890, della prima coltura starter per la produzione di formaggi, aprendo la strada all’industrializzazione delle fermentazioni alimentari (Styles e Holzapfel, 1996; Axelsson, 1998). Il raggruppamento dei LAB comprende un numero molto vasto di generi e specie batteriche, Gram positive, generalmente catalasi negative, in grado di crescere in condizioni di microaerofilia o di anaerobiosi e incapaci di produrre spore. I piø importanti generi di LAB sono Lactobacillus, Lactococcus, Enterococcus, Streptococcus, Pediococcus, Leuconostoc, Weissella, Carnobacterium, Tetragenococcus e Bifidobaterium. Fra questi i LAB appartenenti al genere Lactobacillus sono considerati organismi “generalmente sicuri per la salute umana”, cioè organismi GRAS (generally recognised as safe). I lattobacilli sono microrganismi ampiamente diffusi in natura, prediligono habitat ricchi di nutrienti e fanno parte della normale microflora della bocca, dell’intestino e della vagina umana (Hammes e Vogel, 1995; Vaughan et al., 2002). I lattobaccilli sono stati inoltre individuati come microrganismi in grado di contribuire e promuovere la salute umana, e per questo insieme ai Bifidobatteri, rappresentano la principale categoria microbica impiegata come probiotico. L’influenza sull’ecosistema intestinale di microrganismi positivi derivanti dagli alimenti o dall’ambiente, quali batteri lattici, è stata osservata ancor prima di possedere gli strumenti scientifici per la loro conoscenza. Infatti, nel primo secolo d.C., Plinio il Vecchio illustra l’efficacia terapeutica dei latti fermentati nella cura delle affezioni gastro-intestinale. Döderlein (1892), fu invece il primo a riportare l’esistenza di un’associazione positiva tra microrganismi e uomo, proponendo che i batteri vaginali producono dal metabolismo degli zuccheri, acido lattico che inibisce la crescita di patogeni. Tuttavia si deve all’attività scietifica del premio nobel russo Elie Metchnikoff, l’affermazione del concetto che ci fosse una relazione causa effetto fra salute dell’uomo e consumo di prodotti lattiero - caseari fermentati. Questa pionieristica ipotesi venne

Tesi di Laurea Magistrale

Facoltà: Agraria

Autore: Giovanni Mottolese Contatta »

Composta da 148 pagine.

 

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