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Identificazione di specie ittiche tramite amplificazione del gene per l'rRNA 5S al fine di rilevare frodi tassonomiche

Informazioni tesi

  Autore: Stefano Colavecchio
  Tipo: Laurea liv.I
  Anno: 2009-10
  Università: Università degli Studi dell'Insubria
  Facoltà: Scienze Matematiche, Fisiche e Naturali
  Corso: Scienze biologiche
  Relatore: Rosalba Gornati
  Lingua: Italiano
  Num. pagine: 42

La frode di sostituzione di specie, che si inserisce nella categoria delle frodi per contraffazione, è estremamente diffusa nel mercato ittico e consiste nella sostituzione di alimenti con altri di minor pregio ma con caratteristiche macroscopiche molto simili. E’ di fondamentale importanza, quindi, identificare le specie oggetto di frode in modo rapido e inequivocabile per le implicazioni economiche, sanitarie ed ecologiche connesse ad una etichettatura non corretta. L’identificazione morfologica non è sempre attuabile perché spesso i prodotti ittici vengono venduti in trancio o filetti; l’utilizzo di approcci di identificazione basati sul DNA si rivela quindi utile per risolvere questo problema. Il DNA è una macromolecola altamente stabile anche in seguito ai trattamenti che avvengono durante la trasformazione dei cibi, fornisce numerosi marker per l’identificazione grazie alla presenza di regioni specie-specifiche ed è presente in quasi tutte le cellule dell’organismo indipendentemente dall’età, dal tipo di tessuto e dalle condizioni fisiologiche.

Questo lavoro ha come obiettivo quello di mettere a punto un metodo di identificazione delle specie ittiche mediante amplificazione del gene codificante per l’RNA ribosomiale 5S, un target genetico già utilizzato in diversi lavori in quanto presenta delle caratteristiche favorevoli per tale scopo. Esso è infatti costituito da una sequenza codificante di 120 nucleotidi, molto conservata fra le specie, e una sequenza non codificante (NTS, non transcribed spacer), che varia da specie a specie sia in lunghezza che in sequenza; sequenza codificante più NTS sono ripetuti un numero variabile di volte nel genoma. Disegnando primer sia sulla sequenza conservata che sulla sequenza NTS è quindi possibile ottenere, mediante PCR, degli amplificati specie-specifici.

Il lavoro si è concentrato sull’identificazione di 10 specie ittiche di largo interesse commerciale, abitualmente commercializzate come prodotti lavorati o trasformati e appartenenti principalmente a 4 ordini: Perciformes, Pleuronectiformes, Salmoniformes e Siluriformes. Per prima cosa è stato necessario scegliere un metodo di estrazione del DNA genomico che si adattasse allo scopo del progetto e che garantisse l’ottenimento di un templato di buona qualità e in quantità sufficiente per le successive analisi. Allo scopo sono stati testati due metodi: “lisi overnight” e “urea-SDS-proteinasi K”. Tra i due metodi è stato in seguito scelto il secondo poiché molto più veloce rispetto al primo e con rese paragonabili. Il DNA genomico è stato quindi amplificato tramite PCR utilizzando i primer “universali” per tutte le specie ittiche, ottenuti grazie ad una ricerca bibliografica. Il prodotto ottenuto, corrispondente al gene codificante per l’rRNA 5S di ciascuna specie, è stato sequenziato e analizzato tramite allineamenti, effettuati con il programma “clustalW”, e tramite ricerche in banca dati, usando l’algoritmo BLAST. Sono stati quindi disegnati dei primer specie-specifici sulla sequenza dell’NTS, che hanno dato un amplificato solo in presenza del DNA genomico della specie corrispondente, creando così dei pattern di bande specie-specifici su gel.

Il metodo scelto si è rivelato valido allo scopo di identificare specie ittiche diverse e potrebbe in futuro essere utilizzato per “smascherare” le frodi alimentari più ricorrenti nel mercato ittico.

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Riassunto La frode di sostituzione di specie, che si inserisce nella categoria delle frodi per contraffazione, è estremamente diffusa nel mercato ittico e consiste nella sostituzione di alimenti con altri di minor pregio ma con caratteristiche macroscopiche molto simili. E’ di fondamentale importanza, quindi, identificare le specie oggetto di frode in modo rapido e inequivocabile per le implicazioni economiche, sanitarie ed ecologiche connesse ad una etichettatura non corretta. L’identificazione morfologica non è sempre attuabile perché spesso i prodotti ittici vengono venduti in trancio o filetti; l’utilizzo di approcci di identificazione basati sul DNA si rivela quindi utile per risolvere questo problema. Il DNA è una macromolecola altamente stabile anche in seguito ai trattamenti che avvengono durante la trasformazione dei cibi, fornisce numerosi marker per l’identificazione grazie alla presenza di regioni specie-specifiche ed è presente in quasi tutte le cellule dell’organismo indipendentemente dall’età, dal tipo di tessuto e dalle condizioni fisiologiche. Questo lavoro ha come obiettivo quello di mettere a punto un metodo di identificazione delle specie ittiche mediante amplificazione del gene codificante per l’RNA ribosomiale 5S, un target genetico già utilizzato in diversi lavori in quanto presenta delle caratteristiche favorevoli per tale scopo. Esso è infatti costituito da una sequenza codificante di 120 nucleotidi, molto conservata fra le specie, e una sequenza non codificante (NTS, non transcribed spacer), che varia da specie a specie sia in lunghezza che in sequenza; sequenza codificante più NTS sono ripetuti un numero variabile di volte nel genoma. Disegnando primer sia sulla sequenza conservata e che sulla sequenza NTS è quindi possibile ottenere, mediante PCR, degli amplificati specie-specifici. Il lavoro si è concentrato sull’identificazione di 10 specie ittiche di largo interesse commerciale, abitualmente commercializzate come prodotti lavorati o trasformati e appartenenti principalmente a 4 ordini: Perciformes, Pleuronectiformes, Salmoniformes e Siluriformes. Per prima cosa è stato necessario scegliere un metodo di estrazione del DNA genomico che si adattasse allo scopo del progetto e che garantisse l’ottenimento di un templato di buona qualità e in quantità sufficiente per le successive analisi. Allo scopo sono stati testati due metodi: “lisi overnight” e “urea-SDS-proteinasi K”. Tra i due metodi è stato in seguito scelto il secondo poiché molto più veloce rispetto al primo e con rese paragonabili. Il DNA genomico è stato quindi amplificato tramite PCR utilizzando i primer “universali” per tutte le specie ittiche, ottenuti grazie ad una ricerca bibliografica. Il prodotto ottenuto, corrispondente al gene codificante per l’rRNA 5S di ciascuna specie, è stato sequenziato e analizzato tramite allineamenti, effettuati con il programma “clustalW” (www.ebi.ac.uk/Tools/clustalW2/index.html), e tramite ricerche in banca dati, usando l’algoritmo BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi). Sono stati quindi disegnati dei primer specie-specifici sulla sequenza dell’NTS, che hanno dato un amplificato solo in presenza del DNA genomico della specie corrispondente, creando così dei pattern di bande specie-specifici su gel. I

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Parole chiave

pcr
biologia molecolare
scienze biologiche
specie ittiche
frodi tassonomiche
amplificazione gene
rna ribosomiale 5s

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