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Un approccio metagenomico per studiare comunità naturali di protisti a vita libera.

Informazioni tesi

  Autore: Caterina Romiti
  Tipo: Laurea liv.II (specialistica)
  Anno: 2011-12
  Università: Università degli Studi di Pisa
  Facoltà: Scienze Biotecnologiche
  Corso: Biologia
  Relatore: Graziano Di Giuseppe
  Lingua: Italiano
  Num. pagine: 89

I protisti costituiscono un gruppo polifiletico ed estremamente diversificato che comprende microorganismi unicellulari di natura eucariotica; essi sono la principale fonte di biodiversità sul nostro pianeta e giocano un ruolo essenziale nel mantenere i processi globali, che a loro volta regolano il funzionamento della biosfera. Tuttavia, poco è ancora noto circa l’enorme biodiversità di tali microorganismi. I protisti costituiscono, inoltre, un serbatoio naturale di sostanze bioattive di interesse ecologico-ambientale e industriale. Infatti, alcuni protisti sono in grado di produrre molecole che presentano un potenziale tossicologico che può essere trasmesso attraverso la catena alimentare fino ai suoi livelli terminali (uomo), mentre altre sostanze possono costituire principi attivi di prodotti di interesse farmaceutico, conserviero ed agro-alimentare.
I principali strumenti che vengono attualmente applicati nello studio dei protisti a vita libera provenienti da ambienti diversi richiedono come prerequisito il mantenimento in coltura di tali microorganismi. Tuttavia, con i mezzi di coltura convenzionali spesso non è possibile ripristinare le condizioni ambientali a cui sono adattati questi microorganismi, con conseguente fallimento nella loro moltiplicazione. Così, questi metodi non sempre sono in grado di fornire informazioni complete sulla biodiversità e il potenziale biotecnologico di tali microorganismi presenti in campioni ambientali. Le moderne metodologie molecolari permettono oggi un rapido accesso alla biodiversità microbica e facilitano la scoperta di nuovi gruppi di microorganismi, altrimenti difficilmente identificabili.
Allo scopo di contribuire alla conoscenza della biodiversità dei protisti a vita libera, nel mio lavoro si è utilizzato un approccio metagenomico per studiare comunità naturali di tali microorganismi. La metagenomica è un nuovo approccio della ricerca scientifica, originariamente impiegato per lo studio delle comunità di microbi di natura procariotica, basato sull'utilizzo di tecniche genomiche moderne per lo studio di comunità microbiche direttamente da campioni ambientali, evitando così il problema dell’isolamento e coltura in laboratorio. Si tratta, in pratica, di una tecnologia che prevede di analizzare contemporaneamente il genoma di tutti i microorganismi presenti un in particolare campione ambientale, alla ricerca di nuove specie o per creare un profilo di specie note.
A tale fine, sono stati individuati alcuni habitat acquatici naturali, sia dulciacquicoli che marini, nei quali sono stati fatti dei campionamenti. Dopo una preliminare concentrazione dei campioni mediante centrifugazione, eseguita al fine di separare il sedimento dalla fase liquida, ed una preliminare filtrazione di quest’ultima per mezzo di filtri con maglie di dimensioni variabile, eseguita al fine di escludere dall’analisi i microorganismi di dimensioni superiori a quelle dei protisti, quali ad esempio piccoli crostacei e altri metazoi, i campioni sono stati successivamente sottoposti a tecniche di estrazione di DNA tramite protocolli appositamente messi a punto. I campioni di DNA così ottenuti sono stati successivamente sottoposti ad amplificazione genica tramite la tecnica della PCR. Come marcatore genetico utile per l’identificazione delle specie, è stato selezionato il gene nucleare per l’RNA ribosomale (rRNA) 18S, che è unanimemente ritenuto un buon marcatore specie-specifico. I prodotti di PCR così ottenuti sono stati sottoposti a clonaggio ed i cloni ricombinanti sottoposti a sequenziamento. Le sequenze ottenute sono state poi comparate con quelle omologhe disponibili nelle banche-dati genomiche e sottoposte ad analisi filogenetica.
I risultati ottenuti hanno permesso di identificare, su basi molecolari, diversi taxa di protisti e di delineare un quadro sufficientemente rappresentativo della comunità di protisti dei siti campionati. Allo scopo di ottenere un riscontro delle identificazioni tassonomiche fatte con l’approccio genetico, i campioni ambientali sono stati sottoposti anche ad un’analisi morfologica, effettuata tramite osservazione al microscopio ottico, acquisizione di immagini fotografiche relative ai protisti presenti e successiva identificazione degli stessi su basi morfologiche.

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Parole chiave

estrazione dna
clonaggio
analisi morfologiche
alberi filogenetici
protisti
sequenziamento dna
metagenomica
analisi filogenetiche
rrna 18s
amplificazione dna

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