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Espressione, purificazione e cristallizzazione della Human Lipocalin-type Prostaglandin D Synthase (L-PGDS) wild type

Informazioni tesi

  Autore: Elisa Tecchio
  Tipo: Laurea liv.I
  Anno: 2009-10
  Università: Università degli Studi di Verona
  Facoltà: Scienze Matematiche, Fisiche e Naturali
  Corso: biotecnologie agro-industriali
  Relatore: Massimiliano Perduca
  Lingua: Italiano
  Num. pagine: 28

La prostaglandina D sintasi di tipo lipocalinico è una proteina di 18.7 kDa appartenente alla famiglia delle lipocaline.
Il suo ruolo è quello di trasportare piccole molecole idrofobiche: pigmenti biliari, acido retinoico, retinale, gangliosidi e β-amiloide; inoltre è stato il primo membro delle lipocaline ad essere identificato come enzima. Essa infatti catalizza l’isomerizzazione del gruppo 9,11 endoperossido della prostaglandina H2, precursore dei prostanoidi, nei gruppi 9-idrossi e 11-cheto della prostaglandina D2. La prostaglandina D2 è coinvolta nel mantenimento della temperatura corporea, nella regolazione del corretto funzionamento delle cellule nervose, nel ciclo sonno-veglia, nella sensibilità al dolore, nell’asma allergica, nell’inibizione dell’aggregazione delle piastrine e nel reclutamento chemotattile delle cellule del sistema immunitario.
Lipocalin-type Prostaglandin D synthase (L-PGDS) rappresenta la più abbondante proteina del fluido cerebro spinale seconda solo all’albumina, ma è stata localizzata anche in altri tessuti come cervello, testicoli e prostata umani, nel tessuto cardiaco, nelle cellule della placenta e in macrofagi infiltrati in placche aterosclerotiche.
L’importanza dello studio di questa proteina deriva sia dal suo ruolo fisiologico, sia dal coinvolgimento nella risposta a varie patologie come diabete, lesioni cardiovascolari, leucodistrofia di Krabbe, sclerosi multipla, morbo di Alzheimer e varie neoplasie.
Attualmente i maggiori studi biochimici e strutturali presenti in letteratura riguardano la L-PGDS ricombinante di ratto per cui lo scopo di questo lavoro di tesi è esprimere in vitro L-PGDS wild type (wt) umana ed identificare un protocollo di purificazione che consenta di ottenere la proteina pura ed omogenea in quantità sufficiente da permettere l’allestimento di prove di cristallizzazione.
L’ottenimento di cristalli proteici è particolarmente importante in quanto essi permetteranno, per mezzo della diffrazione di raggi X, di risolvere la struttura della L-PGDS wt umana, la quale non è ancora stata risolta.
Inoltre sarà possibile utilizzare la proteina wt umana per esperimenti di surface plasmon resonance al fine di studiare l’interazione della L-PGDS con opportuni ligandi.

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2 2. INTRODUZIONE 2.1. Lipocaline Le lipocaline sono una famiglia eterogenea di proteine extracellulari ampiamente distribuite in animali, piante e batteri, accomunate dalla proprietà di legare piccole molecole idrofobiche, legare recettori specifici di superficie e di formare complessi covalenti e non covalenti con altre molecole solubili. Le lipocaline hanno dimensioni diverse, tuttavia il dominio che ne determina le proprietà principali possiede un peso di circa 18-20 kDa. Sono caratterizzate da una struttura β altamente simmetrica dominata da un singolo foglietto β, costituito da 8 filamenti antiparalleli, denominati con le lettere da A ad H, chiuso su se stesso a formare un barilotto-β unito da legami idrogeno. Questo circonda un sito di legame composto da una cavità interna e da un’impalcatura esterna a loop. ¨ proprio la diversità nella cavità e nell’impalcatura esterna che permettono differenti modalità di legame ognuno capace di accomodare ligandi di forma, dimensione e caratteristiche chimiche differenti. Gli otto filamenti β del barilotto sono uniti da una successione di connessioni +1. Le sette loops, denominate L1- L7, sono tipiche forcine β, ad eccezione di L1 che possiede la forma di un Ω loop, piø largo e flessibile, il quale forma una calotta ripiegata che va a chiudere parzialmente il sito di legame interno che si trova a quest’estremità del barilotto. Tra il filamento H e quello terminale I si trova un’α-elica, presente in tutte le lipocaline. Nonostante la struttura terziaria sia conservata, l’identità di sequenza amminoacidica è bassa, spesso non supera il 30%. Figura 1: modello di struttura terziaria di una lipocalina.

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Parole chiave

cristallizzazione
cromatografia
plasmide
gene
ligazione
lipocaline
lipocalin-type prostaglandin d synthase
subclonaggio

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