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Analisi multigenerazionale degli effetti di composti perfluorurati (PFAS) su Chironomus riparius (insetti, ditteri): parametri di variabilità genetica e di life-history

La tossicologia evolutiva è lo studio degli effetti dei contaminanti chimici sulla variabilità genetica delle popolazioni, che possono essere di tipo diretto, quali mutagenicità, o indiretto, quali quelli mediati dall’alterazione della fitness riproduttiva (erosione genetica, selezione). Uno degli ambiti di studio dell’tossicologia evolutiva si basa su test ecotossicologici multigenerazionali, ovvero esperimenti di esposizione a lungo termine di organismi a concentrazioni subletali di contaminanti. Tali metodiche si prestano ad un approccio di tipo integrato, in quanto permettono di valutare in parallelo gli effetti su parametri di life-history (detti life-traits) e su parametri genetici. In questo modo è possibile distinguere la componente microevolutiva adattativa delle popolazioni dalla risposta fisiologica compensativa: la prima, maggiormente impattante e meno reversibile, la seconda, di carattere più transitorio.
Le sostanze alchiliche perfluorurate (PFAS) sono composti idrorepellenti con elevata stabilità termica e chimica, caratterizzati da elevata persistenza in ambiente e in grado di bioaccumulare nelle matrici biotiche. I PFAS sono molto diffusi sia nei comparti biotici che abiotici e, in particolare, negli ambienti acquatici.
Obiettivo della tesi è indagare gli effetti tossici a lungo termine indotti dall’esposizione di popolazioni naturali di Chironomus riparius (Insetti, Ditteri) ad acido perfluoroottasolfonico (PFOS), acido perfluorottanoico (PFOA) e acido perfluorobutansolfonico (PFBS), ossia i composti più diffusi negli ecosistemi acquatici italiani. Il test è stato condotto per 10 generazioni consecutive, utilizzando concentrazioni nominali di contaminanti di 10 µg/l, paragonabili ai livelli massimi riscontrati nei corsi d’acqua italiani. I test sono stati condotti secondo le indicazioni dei protocolli OECD n. 218 e n. 233, allestendo per il controllo e per ogni trattato 10 repliche contenenti 60 larve ciascuna. Al termine dell’esperimento è stato allestito un test cronico finale, esponendo tutte le popolazioni a concentrazioni nominali di 100 µg/l di PFOS e 200 µg/l di PFOA, al fine di evidenziare possibili fenomeni di resistenza acquisita ai contaminanti. La variabilità genetica è stata stimata sulla base di 5 loci microsatelliti, e sono stati adottati in via sperimentale approcci basati sulla teoria della coalescenza e sull’analisi bayesiana al fine di indagare l’evoluzione temporale sia di descrittori di variabilità genetica, quali l’eterozigosità o la diversità allelica, sia dei parametri intrinseci della popolazione, quali la dimensione genetica effettiva ed il tasso medio di mutazione. Per quanto riguarda i life-traits, sono stati analizzati la sopravvivenza (Emergence Ratio), lo sviluppo (Developmente Rate, Mean Emergence Time), la crescita (peso delle larve, peso degli adulti e lunghezza delle exuvie pupali maschio e femmina) e la riproduzione (numero di cordoni di uova fertili deposti da ogni femmina, numero medio di uova per cordone, numero di uova schiuse a 5 giorni dalla deposizione, sex ratio, Population Growth Rate).
Gli organismi esposti al PFOS hanno mostrato nel corso delle dieci generazioni un mantenimento del numero di alleli e dell’eterozigosità maggiore rispetto alle popolazioni di controllo. Ciò è stato imputato ad un maggiore tasso di mutazione, accompagnato da una progressiva maggiore resistenza suggerita dall’analisi dei life-traits, confermando che il PFOS, rispetto agli altri composti, determina un maggiore impatto sulle popolazioni. La risposta dei life-traits al PFOA si è rivelata in alcuni casi simile a quella per il PFOS, con riduzione della crescita e del tasso di sviluppo, ma non dei parametri di riproduzione. Ciò risulta congruente con l’assenza di effetti chiaramente visibili a livello genetico, mettendo in evidenza la potenziale capacità del PFOA di causare stress di tipo fisiologico e non genetico. Per quanto riguarda il PFBS, l’analisi genetica ha mostrato un andamento simile al PFOS, con un aumentato tasso di mutazione nel corso delle generazioni, seppur di minore entità, mentre l’analisi dei life-traits ha indicato l’insorgere di effetti nelle ultime generazioni, in concomitanza con un aumentato stress da allevamento delle popolazioni; pertanto la sostanza potrebbe rappresentare un fattore di rischio per popolazioni naturali già fortemente stressate da altre pressioni. Questi risultati sono stati in parte confermati del test cronico finale, che ha evidenziato una risposta simile di tutte le popolazioni al PFOA e una tendenza ad acquisire maggiore resistenza al PFOS delle popolazioni precedentemente esposte a questo contaminante per 10 generazioni.
In conclusione, l’approccio multigenerazionale si è dimostrato uno strumento efficace per determinare gli effetti subletali causati dall’esposizione a lungo termine degli organismi a composti a bassa tossicità.

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5 1. INTRODUZIONE 1.1 TOSSICOLOGIA EVOLUTIVA La tossicologia evolutiva è lo studio degli effetti dei contaminanti chimici sulla struttura genetica delle popolazioni naturali. Questa giovane disciplina utilizza le metodiche sperimentali tipiche dell’ ecotossicologia, ovvero la selezione di biomarcatori, la comparazione tra popolazioni di controllo e popolazioni esposte e analisi della correlazione tra dose ed effetto. A livello concettuale si basa sulla teoria evolutiva e sulla biologia della conservazione, con metodi analitici propri della genetica di popolazione. A livello tossicologico gli effetti dei contaminanti sulla struttura genetica delle popolazioni possono essere diretti o indiretti. Nel primo caso ci si riferisce a contaminanti mutagenici, chiamati genotossici, che causano danni diretti alla molecola di DNA attraverso processi quali sostituzioni di basi, delezioni, duplicazioni e modificazioni strutturali dei cromosomi. Gli effetti indiretti sono invece provocati da contaminanti non genotossici, ma, in ultima analisi, capaci di alterare la struttura genetica e il potenziale evolutivo della popolazione. A partire dai numerosi lavori in letteratura, è possibile riconoscere 4 tipologie di effetti indiretti a livello di genetica di popolazione, che si manifestano singolarmente o in combinazione (Bickham 2011). Un tipo di effetto è l’erosione genetica, ovvero la riduzione della variabilità genetica a seguito della drastica riduzione della dimensione della popolazione; la forte diminuzione della fitness riproduttiva provoca la perdita di variabilità per deriva genica (van Straalen e Timmermans 2002). Questo processo, avendo effetti diffusi sull’intero genoma, può essere analizzato utilizzando marcatori genetici neutrali, come i microsatelliti. Un secondo tipo di effetto è l’alterazione delle frequenze alleliche o genotipiche causate dalla selezione direzionale indotta dal contaminante. In questo processo sono coinvolti i geni essenziali per la sopravvivenza. Lo studio può quindi concentrarsi sull’individuazione e sulla caratterizzazione di questi loci. Altro tipo di effetto è l’alterazione della capacità dispersiva o del flusso genico, che possono modificare le relazioni genetiche tra le popolazioni. Lo studio della distribuzione aplotipica tra diverse sottopopolazioni può portare, ad esempio, all’individuazione di “aree pozzo” contaminate, nelle quali il basso successo riproduttivo non permette un ottimale flusso genico all’interno dell’areale della popolazione. In un’ottica biogeografica, si genererebbero gli stessi effetti causati dalla frammentazione di habitat o dall’insorgenza di una barriera riproduttiva. Infine, un altro tipo di effetto è il cambiamento delle frequenze alleliche dovuto all’aumento del tasso di mutazione. Talvolta la deriva genetica può essere compensata da un aumento del tasso di mutazione, che può verificarsi, ad esempio, nei casi di eteroplasmia mitocondriale.

Tesi di Laurea Magistrale

Facoltà: Scienze Matematiche, Fisiche e Naturali

Autore: Alessio Fumagalli Contatta »

Composta da 93 pagine.

 

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Disponibile in PDF, la consultazione è esclusivamente in formato digitale.