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Effetto di tirfostine sulla fosforilazione in vitro del recettore per EGF

Durante il periodo di internato, mi sono occupata di un progetto ad ampio respiro, che prevede la progettazione, la sintesi e la caratterizzazione biologica di potenziali inibitori tirosina-chinasici, ATP-antagonisti, in grado di inibire la fosforilazione del recettore per EGF.
Il lavoro si articola in fasi complementari: la prima, di cui si occupa più direttamente A. Romani presso il Dipartimento di Medicina Sperimentale, Sezione Patologia molecolare e Immunologia, comprende la parte di progettazione e lo sviluppo di nuove molecole.
In questa fase del lavoro si è reso necessario costruire, mediante "Homology Modelling", il modello tridimensionale del dominio tirosina-chinasico di EGFR, in quanto la sua struttura non è stata ancora determinata sperimentalmente.
Da studi sul meccanismo di trasferimento del gruppo fosfato dell'ATP alla tirosina del substrato, è stato possibile ricavare, in seguito, i gruppi farmacofori che dovevano essere presenti in molecole ad attività inibitoria nei confronti di EGFR.
Mediante CADD ("Computer Aided Drug Design") sono state disegnate molecole che contenessero tali gruppi.
E' stato, infine, valutato il comportamento di tali molecole nel sito di legame dell'ATP.
Una volta valutato il corretto posizionamento nel sito, la seconda fase del lavoro prevede la sintesi di questi composti. Della parte di sintesi si è occupato Pierluigi Zambelli, presso il Laboratorio di Chimica Organica e Industriale, con l'aiuto della Prof. Cornia.
La terza, ed ultima fase della ricerca prevede la caratterizzazione biologica di tali composti.
Delle tre fasi di questo lavoro, mi sono occupata principalmente della caratterizzazione biologica ed oggetto di questa tesi è proprio la presentazione di come questa fase del lavoro è stata impostata, come si è sviluppata ed i risultati che sono stati ottenuti.
Per la caratterizzazione biologica delle nostre molecole abbiamo utilizzato una linea cellulare tumorale denominata A-431, che iperesprime il recettore per EGF.
La valutazione dell'attività biologica delle nostre molecole si è svolta inizialmente a livello della proliferazione di tali cellule, ovvero valutando lo stato delle cellule in coltura dopo varie ore d'incubazione con il composto (dati non mostrati in questo lavoro di tesi); si tratta però di uno studio troppo indiretto, per questo abbiamo deciso di analizzare l'effetto delle molecole direttamente sul recettore EGFR.
Queste molecole sono state disegnate come antagonisti dell'ATP, che dovrebbero inserirsi nel sito di legame del nucleotide, come ottenuto al computer nelle prove di docking fra molecola e sito di legame dell'ATP in EGFR, bloccandone l'attivazione.
Come effetto primario, quindi, questi composti dovrebbero (anche in presenza del fattore di crescita specifico e dell'ATP) inibire l'autofosforilazione del recettore.
Siamo andati a valutare mediante prove di Western Blotting l'inibizione dell'autofosforilazione di EGFR in presenza dei nostri composti
Questa tecnica permette di evidenziare, tramite l'impiego di un anticorpo anti-fosfotirosina, specifico per il recettore, la presenza di tirosine fosforilate nel dominio C-terminale di EGFR che ne provano l'attivazione.
L'approccio biologico, da noi scelto, prevede la valutazione dell'attività dei nostri composti affiancata a quella di inibitori tirfostinici noti, quali AG 1478, Genisteina e Dianilinoftalimide (questi ultimi sono stati utilizzati per valutare la validità dei test biologici utilizzati).
Inizialmente questa indagine si è svolta su cellule intere in coltura, successivamente, per migliorare l'approccio biologico, ho cercato di mettere a punto una metodica che, permettesse di valutare in maniera precisa l'attività di queste molecole in un sistema acellulare. Tale sistema risulta costituito da estratti cellulari, ovvero porzioni di varia lunghezza del "bilayer" fosfolipidico, ottenute in seguito a lisi cellulari e centrifugazioni successive.
Questo ha comportato una serie d

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1 INTRODUZIONE La crescita cellulare è un processo regolato molto finemente che risponde alle necessità specifiche dell’organismo. In maniera del tutto occasionale, i raffinati controlli che regolano la proliferazione cellulare, possono venir meno ed una cellula comincia a crescere e a dividersi in maniera del tutto incontrollata. Il risultato è la comparsa di un clone di cellule modificato, “trasformato”, capace di espandersi indefinitamente ed autonomamente. Questo clone può svilupparsi come una vera e propria massa tumorale (J. Darnell, H. Lodish et D. Baltimore, 1995). La maggior parte dei trattamenti impiegati nella cura del cancro cerca di combattere le caratteristiche peculiari di tale malattia, quali la crescita incontrollata, la penetrazione nei tessuti circostanti e il processo di metastatizzazione. L’approccio chirurgico è stato il primo trattamento introdotto e rimane la scelta più frequente. La rimozione della massa tumorale visibile non garantisce l’eliminazione di tutte le estensioni microscopiche tipiche del cancro, inoltre non è in grado di trattare tumori con metastasi troppo diffuse. La radioterapia (irradiazione con raggi X o gamma di notevole energia) è in molti casi preferibile alla chirurgia, ma anch’essa presenta alcune limitazioni; non sempre riesce a eliminare tutte le cellule cancerose e non è in grado di trattare metastasi diffuse. Spesso si ricorre alla chemioterapia, che consiste nella somministrazione per via sistemica di farmaci antitumorali che vengono trasportati all’interno dei vasi sanguigni in tutti i distretti dell’organismo.

Tesi di Laurea

Facoltà: Scienze Matematiche, Fisiche e Naturali

Autore: Maura Poli Contatta »

Composta da 97 pagine.

 

Questa tesi ha raggiunto 2389 click dal 20/03/2004.

 

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Disponibile in PDF, la consultazione è esclusivamente in formato digitale.