Analisi di numerosità campionaria in esperimenti di espressione genica realizzati con i microarray

Dopo la fase di elaborazione dell’immagine ed estrazione dei dati di intensità eseguita mediante software dedicati, i dati prodotti per ogni gene su ciascun microarray sono costituiti da una coppia di valori di intensità, uno nel canale rosso e l’altro nel verde.
In generale, i dati utilizzati nella successiva fase di analisi sono ottenuti sottraendo ai dati grezzi il valore medio o mediano del background. Il background o rumore di fondo è dovuto a diversi fattori tra cui l’instaurarsi di legami aspecifici fra il supporto del microarray e il campione ibridizzato, la fluorescenza propria dei reagenti utilizzati nella fase di “spotting”, la contaminazione, durante la fase di “spotting”, di aree esterne allo spot da parte della soluzione contenente le sonde, che consente l’ibridizzazione del campione marcato anche dove non dovrebbe avvenire). Inoltre, per poter utilizzare gran parte dei metodi di analisi che verranno illustrati nei prossimi paragrafi, è necessario operare delle trasformazioni sui dati. La trasformazione più frequentemente utilizzata è quella logaritmica perché dà luogo ad una distribuzione dei dati approssimativamente normale, condizione, questa, necessaria per l’applicabilità di numerosi test statistici. Utilizzando questa scala, y_ijkg indica il logaritmo (in base 2) dell’intensità della fluorescenza misurata per l’array i, il fluorocromo j, la varietà o trattamento k e il gene g.

Poiché l‘obiettivo di uno studio di “class comparison” è l’identificazione dei geni differenzialmente espressi tra due o più classi di campioni, il dato di interesse è in realtà rappresentato dalla differenza ( y_ijkg − y_ijk'g) (dove k e k’ si riferiscono a due varietà), che equivale ad un rapporto (“log-ratio”). Esso rappresenta il valore relativo di espressione genica e coincide con il logaritmo del “fold-change”. Nel caso di disegni sperimentali particolarmente semplici come il “reference design”, l’analisi dei dati può essere eseguita confrontando direttamente i “log-ratio“ per mezzo di opportuni test statistici (per esempio il t-test). Grazie alla sua semplicità, questo tipo di approccio è stato utilizzato per anni da molti ricercatori (Callow et al., 2000; Geiss et al., 2000); esso tuttavia ha dei seri limiti per quanto riguarda la scelta delle tipologie di disegno alle quali può essere applicato. Per tale motivo sono stati sviluppati dei metodi più generali che verranno illustrati in dettaglio nel seguito del capitolo.

I metodi statistici utilizzati per operare la verifica di ipotesi scientifiche sono denominati test delle ipotesi o test di significatività. Partendo dalla descrizione delle procedure utilizzate per verificare l’ipotesi che due trattamenti diversi producono in media lo stesso effetto su una qualche variabile (nel caso dei microarray, il livello di espressione di un gene), il test di significatività può essere generalizzato per consentire l’analisi di dati ottenuti da esperimenti che coinvolgono più di due gruppi o trattamenti.
Per eseguire un test delle ipotesi bisogna innanzitutto definire chiaramente il problema di interesse. Si supponga, per esempio, di voler studiare l’effetto sul profilo di espressione genica di un nuovo farmaco antitumorale su animali da esperimento. Poiché è impossibile pensare di testare il farmaco su tutti i soggetti, si estrae casualmente dalla popolazione di animali un certo numero di individui (il campione), assicurandosi che siano il più possibile rappresentativi dell’intera popolazione. Si divide quindi il campione in due gruppi e si procede al trattamento di un gruppo con il nuovo farmaco e dell’altro con un placebo. Attraverso un esperimento microarray si vogliono identificare quali geni risultano differenzialmente espressi nel campione dei trattati rispetto a quello dei controlli.