Ceppi di Escherichia coli isolati da sedimenti marini: diversità genetica, metallo-resistenza e produzione di biofilm

Campioni di sedimento (20 g) prelevati dalle diverse stazioni venivano risospesi in soluzione fisiologica (200 ml) e sottoposti a 3 cicli di sonicazione da 1 min a 60 W, in modo da staccare i microrganismi dalle particelle di sedimento. Aliquote del liquido contenente le cellule batteriche veniva filtrato attraverso membrane di nitrocellulosa con pori di diametro 0,22 µm. Le membrane venivano poi posizionate su terreno FC (Faecal Coliform, Biolife Italiana, s.r.l. Milano) agar e incubate a 44,5° C per 24 ore.

Successivamente all’incubazione veniva valutato il numero di colonie cresciute.
Le colonie di colore blu intenso, ovvero i probabili coliformi fecali, venivano quindi ripassate sul terreno MacConkey (MC, Oxoid, Basingstoke, UK) agar per l’isolamento e l’identificazione dei presunti ceppi di Escherichia coli. L’identificazione delle colonie é stata eseguita attraverso il metodo della PCR (Polymerase Chain Reaction) del gene uidA codificante per l’enzima specifico β-Dglucuronidasi (www.shigatox.net), specifico per l’organismo E. coli.

Gli isolati che si mostravano negativi alla PCR per il gene uidA, ma il cui aspetto morfologico era quello tipico della specie E. coli, venivano ulteriormente identificati mediante il sistema di gallerie API 20E (API, BioMérieux, Marcy l’Etoile, France).

Le gallerie API consistono in una serie di microtubi contenenti dei substrati disidratati utili per evidenziare le attività enzimatiche del ceppo analizzato o la capacità di fermentare alcuni zuccheri. Al fine di evitare l’essiccamento dei test durante l’incubazione, si procede prima di tutto aggiungendo circa 5 ml di acqua nel supporto della galleria. La preparazione dell’inoculo si effettua prelevando una o più colonie di concentrazione di 0,5 McFarland, corrispondente 10cellule/ml. La distribuzione nei microtubi deve essere effettuata con una pipetta Pasteur e, là dove richiesto, si riempiono le cupole del microtubo con olio di paraffina (lo scopo é quello di creare l’ambiente anaerobico). Dopo aver chiuso il contenitore con l’apposito coperchio, le gallerie vengono incubate a 37° C per 24-48 ore. Prima di effettuare la lettura dei risultati, si procede con l’aggiunta di reattivi specifici nei microtubi in cui é richiesto. Si procede con l’annotazione delle reazioni spontanee e di quelle in cui sono stati aggiunti i reattivi, interpretando i viraggi di colore avvenuti e riferendosi all’apposita tabella di lettura fornita assieme al test. I risultati delle reazioni vengono poi codificati in un profilo numerico (con un valore di 1, 2 o 4) di 7-8 cifre che ci consente di identificare il nostro isolato attraverso il confronto di tale profilo con quelli contenuti in un indice analitico o in un programma di identificazione. Le informazioni che ci vengono fornite sono: il nome della specie, gli eventuali test che contrastano con l’identificazione ottenuta e la qualità dell’identificazione stessa.