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Due metodi innovativi per correggere la trisomia 21: silenziamento mediato da XIST e rimozione del cromosoma extra

Analisi del Cariotipo

Nel lavoro di Russel e colleghi, di alcuni cloni è stato analizzato il cariotipo, numero e morfologia dei cromosomi di una cellula, ottenuto tramite bandeggio cromosomico, svolto dal Cytogenetic Laboratory of the Department of Pathology, University of Washington (Seattle, WA). Per ogni linea cellulare sono stati analizzati almeno cinque cariotipi. In particolare, come metodica di colorazione dei cromosomi è stata usata quella del bandeggio G: colorazione di Giemsa che restituisce una immagine nella quale ogni cromosoma risulta formato da bande chiare alternate a bande scure.
Cromosomi diversi, non omologhi, ad esempio il cromosoma 2 e il 14, hanno una diversa disposizione delle bande cromosomiche da una loro estremità telomerica all’altra, e ciò permette la loro classificazione.
L’analisi del cariotipo è stata svolta anche da Lawrence e colleghi, su cromosomi in pro-metafase, tramite il metodo standard del bandeggio G tripsina giemsa (trattamento dei cromosomi con tripsina prima di colorazione con giemsa). Nel loro lavoro, le cellule iPS sono state trattate con 100 ng/ml di KaryMAX colcemid (Invitrogen), sostanza che arresta le cellule in metafase, per 2-4 ore a 37°C in un incubatore a 5% CO2, tripsinizzate, trattate con una soluzione ipotonica, e fissate con metanolo:acido acetico (3:1). Cellule in metafase, almeno 20 per clone, sono state disposte su di un vetrino per microscopio ed analizzate.
Lawrence e colleghi hanno svolto sulle cellule anche analisi di CGH.
L’ibridazione genomica comparativa, CGH, è una tecnica che permette di analizzare, in un unico esperimento, l’intero genoma di una cellula, ed è stata sviluppata per individuare l’eventuale presenza di un numero anomalo di cromosomi come anche di inserzioni, duplicazioni o delezioni di piccole sequenze di DNA. La tecnica si basa sulla competizione di legame di due DNA genomici, marcati con due fluorocromi differenti (come verde e rosso), con il genoma non marcato di una cellula sana: la miscela contenente i due genomi viene disposta su di una piattaforma sulla quale sono fissati frammenti di DNA rappresentativi di tutto il genoma di una cellula sana, così da permettere l’ibridazione tra il DNA dei campioni e il DNA fissato. Ad ogni frazione del genoma corrisponderà un segnale, verde, rosso o di un colore intermedio, a seconda di quale dei due campioni di DNA conteneva una maggior quantità di quel frammento (ad esempio segnale intensamente verde per un frammento maggiormente presente nel genoma del campione marcato di verde), il quale ha avuto quindi una maggior possibilità di legarsi alla piattaforma rispetto al frammento dell’altro campione.

Questo brano è tratto dalla tesi:

Due metodi innovativi per correggere la trisomia 21: silenziamento mediato da XIST e rimozione del cromosoma extra

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Informazioni tesi

  Autore: Simona Sala
  Tipo: Laurea liv.I
  Anno: 2013-14
  Università: Università degli Studi di Milano - Bicocca
  Facoltà: Scuola di scienze
  Corso: Biotecnologie
  Relatore: Michela Clerici
  Lingua: Italiano
  Num. pagine: 70

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Parole chiave

trisomia 21
sindrome di down
xist
tkneo
silenziamento cromosomico
zinc finger nucleasi
gene targeting
integrazione genica mirata

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