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Proteomica degli exosomi urinari per la ricerca di biomarcatori nella nefropatia diabetica e nelle tubulopatie ereditarie

Validazione del contenuto differenziale di alcune proteine negli exosomi urinari di ratti diabetici e controlli

Sulla base di un’accurata analisi dei risultati ottenuti mediante la quantificazione labelfree e delle informazioni reperite in letteratura, sono state selezionate alcune proteine il cui contenuto differenziale negli exosomi urinari dei ratti diabetici e controlli è stato quindi validato mediante immunblotting, non solo a 20 settimane come nell’approccio label-free, ma anche a 6 e 12 settimane. L’intensità delle bande ê stata quantificata mediante densitometria, dopo normalizzazione rispetto alla quantità di proteine caricate, ed i risultati sono stati visualizzati sottoforma di box-plot. Le proteine scelte sono la Xaa-Pro-Dipeptidase (PEPD), la neprilisina (CD10) e la Major-Urinary-Protein-1 (MUP1).

La Xaa-Pro-Dipeptidase (o Prolidase o PEPD) è una proteina del peso molecolare di 54,8 kDa facente parte delle metalloproteasi di matrice, è espressa a livello dei tubuli renali e ha un ruolo chiave nel riciclaggio della prolina per la sintesi del collagene [Nirmalan NJ et al., 2011]. I livelli di questo enzima sono risultati significativamente incrementati negli exosomi dei ratti diabetici rispetto ai controlli; questo risultato è stato replicato e quindi validato mediante IB (fig. 38), dal quale emerge anche che il contenuto di PEPD sembra correlare fortemente con l’avanzamento della DN, essendo progressivamente più elevato all’aumentare dell’età dei ratti ZDF. PEPD potrebbe quindi costituire un promettente marcatore di progressione della patologia. E’ noto che l’attività di PEPD nel siero risulta fortemente aumentata in pazienti diabetici con neuropatia, rispetto a pazienti diabetici senza neuropatia e ad individui sani di controllo [Uzar E et al., 2012]. Questi dati sono considerati di grande interesse, in quanto l’attività di PEPD, riflettendo il metabolismo del collagene e quindi della matrice extracellulare, potrebbe essere considerata come un promettente marcatore candidato di microangiopatia e di altre modificazioni tissutali che riguardano la matrice stessa, in presenza di diabete.

La Major Urinary Protein-1 (MUP-1) è una proteina a basso peso molecolare appartenente alla famiglia delle lipocaline, proteine secrete coinvolte nel legame e nel trasporto di ferormoni o altre molecole idrofobiche a basso peso molecolare [Beynon RJ et al., 2004]. Il contenuto di questa proteina risulta fortemente ridotto negli exosomi urinari dei ratti diabetici rispetto ai controlli alle diverse età, confermando il dato ottenuto dalla quantificazione label-free (fig. 39). Nel ratto, la proteina MUP-1 è in grado di regolare il metabolismo glucidico e lipidico, anche se il meccanismo di base con cui questo avviene non è noto [Zhou Y et al., 2009]; è stato però suggerito che l’assenza o la ridotta espressione di MUP-1 potrebbe contribuire alla globale alterazione metabolica presente nei topi obesi/diabetici.

Sembra inoltre che la MUP-1 sia correlata con la sensibilità all’insulina; ristabilendo, mediante clonaggio genico, la normale espressione di questa proteina in un modello murino di diabete di tipo 2, vengono ridotte la concentrazione di insulina nel sangue ed il contenuto lipidico dei muscoli scheletrici [Hui X et al., 2009]. E’ stato visto che a seguito della diminuzione dell’espressione di geni importanti coinvolti nella gluconeogenesi e nella lipogenesi, la proteina MUP-1 è in grado di bloccare la gluconeogenesi e la lipogenesi a livello epatico [Hui X et al., 2009; Zhou Y et al., 2009; Giller K et al., 2013]. I risultati da noi ottenuti mediante MS e Western Blotting ci permettono di ipotizzare che una compromissione nella produzione di tale proteina o del suo inserimento negli exosomi si accompagni alla progressione della nefropatia nei ratti ZDF. Nell’uomo non ê ancora stata dimostrata l’esistenza di questa proteina anche se ê stato osservato che il genoma umano contiene un gene omologo (accession number: XM_001723632) che dovrebbe codificare per una proteina MUP-1 like (denominate hMUP) avente una sequenza aminoacidica identica al -50% rispetto alla MUP-1 murina; quindi è possibile ipotizzare che anche hMUP possa svolgere una funzione nella regolazione del metabolismo glucidico e lipidico [Zhou Y et al., 2009; Zhou Y et al., 2010; Giller K et al., 2013].

Infine, CD10, conosciuta anche come neprilisina o common acute lymphoblastic lymphoma antigen (CALLA), è una glicoproteina di membrana del peso molecolare di 100 kDa, già descritta come componente degli exosomi urinari e coinvolta nel taglio e nell’inattivazione di molti peptidi fisiologicamente attivi [Merchant ML et al., 2010, Conde-Vancells J et al., 2010]. Questa proteina è stata originariamente identificata a livello dei linfoblasti di pazienti con leucemia linfoblastica acuta di tipo pre-B [Ritz J et al., 1980] ed utilizzata, da quel momento, come marcatore di alcune forme di leucemia e linfoma [Ohshmia K et al., 2001]. E’ normalmente espressa anche nei tessuti non ematopoietici, in particolare nel polmone e nel rene, dove è presente a livello dei tubuli prossimali e dell’epitelio glomerulare.

Proprio a livello renale, si ritiene che CD10 contribuisca ad inattivare peptidi quali la bradichinina, l’angiotensina, la sostanza P [Sahli S et al., 2005]. La quantificazione label-free mostrava che CD10 è presente in quantità statisticamente non differenziale negli exosomi urinari dei ratti ZDF e dei corrispondenti controlli a 20 settimane, e questo risultato viene confermato mediante IB anche a 6 e 12 settimane (fig. 40). In accordo con questo risultato, il contenuto exosomiale di CD10 potrebbe essere usato come standard per la normalizzazione, una sorta cioè di proteina housekeeping, tra due set sperimentali, come confermato in un lavoro di Rood IM et al. che suggeriscono CD10 come marcatore specifico degli exosomi [Rood IM et al., 2010].

Questo brano è tratto dalla tesi:

Proteomica degli exosomi urinari per la ricerca di biomarcatori nella nefropatia diabetica e nelle tubulopatie ereditarie

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Informazioni tesi

  Autore: Samuele Corbetta
  Tipo: Tesi di Dottorato
Dottorato in Tecnologie Biomediche
Anno: 2015
Docente/Relatore: Marina Pitto
Correlatore: FrancescaRaimondo
Istituito da: Università degli Studi di Milano - Bicocca
Dipartimento: Dipartimento di Scienze della Salute
  Lingua: Italiano
  Num. pagine: 179

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Parole chiave

proteomica
nefropatia
urine
exosomi
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