Effetto della temperatura nella preparazione e nell'uso di nano-colonne HPLC

Prima di procedere all’impaccamento è necessario degasare il solvente che servirà a spingere lo slurry nel capillare, lavare il reservoir con il solvente e collegarlo al reservoir. Lo slurry viene introdotto nel reservoir che viene collegato alla pompa. A questo punto si può attivare la pompa: l’acetonitrile viene spinto nel capillare, passando per il reservoir. In questo modo il solvente spinge la fase stazionaria che va a riempire la colonna. Quest’ultima termina con il frit, cioè un filtro di una porosità tale da permettere alla fase mobile di attraversarlo, ma che trattiene la fase stazionaria.
Affinché la colonna si impacchi nel modo migliore, la pressione operativa deve essere la più alta possibile, compatibilmente con la tenuta dei materiali ed i requisiti strumentali. La pompa usata in questo lavoro può supportare una pressione massima di 375 bar. Una volta riempita, si lascia flussare la colonna in acetonitrile, riducendo gradualmente il flusso. Questo passaggio è molto delicato poiché se la pressione calasse bruscamente, la fase stazionaria sarebbe risucchiata nel reservoir, compromettendo l’impaccamento della colonna.
Impaccamento a caldo.
Partendo dall’osservazione che la sospensione è più stabile a temperatura più alta, abbiamo messo a punto un procedimento a caldo. In questo è stato inserito anche l’uso del sonicatore: infatti durante l’impaccamento si possono formare dei tappi che inizialmente venivano rimossi “vibrando” il reservoir. L’uso del sonicatore sostituisce meglio questa azione meccanica ed evita la formazioni di eventuali tappi. L’impaccamento a caldo è molto simile a quello a freddo, con alcune differenze.
Innanzitutto è utilizzata una piastra che riscalda l’acqua contenuta in un recipiente la quale viene portata a 70°C. L’acqua viene poi versata in un bagno a ultrasuoni in cui sia il reservoir sia la colonna vengono immersi. Questa fase è piuttosto delicata ed è fondamentale che l’operatore faccia in modo che il frit della colonna, sottoposta all’azione degli ultrasuoni, non si rompa sbattendo contro le pareti del sonicatore.