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Messa a punto e validazione di una metodica HPLC-UV per il dosaggio della Doxofillina plasmatica

Preparazione dei calibratori e dei controlli di qualità

Una validazione presuppone innanzi tutto la costruzione di curve di calibrazione nella matrice desiderata (nel nostro caso plasma). Una curva di calibrazione è la rappresentazione grafica della relazione tra il segnale rilevato dallo strumento ed i valori di concentrazione (noti) dell’analita. Per ogni analita da quantificare presente nel campione deve essere realizzata una curva di calibrazione, ossia un range di punti a concentrazione di analita crescente. Una buona curva di calibrazione deve essere costruita utilizzando un certo numero di standard (>3).

Il LOQ (Limite di Quantificazione) è il più basso livello di concentrazione presente nella curva di calibrazione misurabile con accuratezza e precisione accettabili (5 volte il segnale del bianco).

Il LOD (Limite di Determinazione) è, invece, la concentrazione di analita che produce un segnale statisticamente differente da quello del “bianco”. Una corretta validazione prevede, infatti, di eseguire un numero adeguato di misure replicate del “bianco” in modo da stimare la distribuzione del segnale ad esso relativo.

Per definizione, si considera significativamente diverso dal “bianco” un segnale pari al segnale medio di questo più 3 volte la sua deviazione standard. La misurazione del “bianco” risulta estremamente importante perché rappresenta la misura del segnale analitico effettuata in presenza di tutte le componenti presenti nel campione, eccetto l’analita d’interesse.

I controlli di qualità (QC) vengono preparati, invece, soltanto su (almeno) tre diversi livelli di concentrazione: uno vicino alla concentrazione del LOQ, uno a metà ed uno vicino al limite superiore del range di calibrazione. I QC servono per monitorare la performance globale del metodo, permettendo la verifica dei dati ottenuti in fase di validazione.

Perché la validazione sia conclusa, più set di calibratori e di QC debbono essere analizzati in HPLC, su diverse giornate di lavoro, previa estrazione specifica dell’analita dalla matrice.

Questo brano è tratto dalla tesi:

Messa a punto e validazione di una metodica HPLC-UV per il dosaggio della Doxofillina plasmatica

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Informazioni tesi

  Autore: Giovanni Pistidda
  Tipo: Diploma di Laurea
  Anno: 2014-15
  Università: Università degli Studi di Torino
  Facoltà: Medicina e Chirurgia
  Corso: Tecniche di Laboratorio Biomedico
  Relatore: Silvia Racca
  Lingua: Italiano
  Num. pagine: 61

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hplc
metilxantine
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