Studio dell’interazione di batteri purpurei non sulfurei fotosintetici con Cadmio e Tellurio per la sintesi di nanoparticelle o Quantum Dots

Per purificare eventuali prodotti della riduzione batterica intracellulari o extracellulari e altri precipitati è stato seguito il seguente protocollo:

.Allestire e far crescere fino all’OD 0,8-1,0 una coltura da 1/5 L con le concentrazioni volute e le sostanze desiderate.
.Centrifugare tutta la coltura in tubi Beckman da 250 mL; rotore JA-14, 10.000 RPM, 4°C per 20 minuti.
.Risospendere i pellet in tampone Gly-Gly (50 mM, pH 7.4), raccogliere tutto il materiale solido in un altro tubino da centrifuga e centrifugare di nuovo con rotore JA-25.50, 18.000 RPM, 4°C per 20 minuti.

A questo punto il materiale può essere lisato con la French press per raccogliere le particelle intracellulari, può essere ulteriormente trattato e separato con gradienti di saccarosio o passare attraverso entrambi i processi.
A) Protocollo per purificare il materiale dopo la lavorazione alla French press:

. Centrifugare il lisato con rotore JA-25.50, 15.000 RPM, 4°C per 30 minuti.
. Il pellet può essere separato su gradienti di saccarosio (punto B) mentre il surnatante viene precipitato con ultracentrifuga: 40.000 RPM, 4°C, 90 minuti con bilanciamento dei tubini preciso al mg.
. Eliminare il surnatante e risospendere in 1-2 mL di buffer contenente EDTA 0,05 M, NaOH 1 N, SDS 0,1% e trasferire in una eppendorf.
. Centrifugare le eppendorf a 13.000 RPM per 5 minuti.
. Eliminare il surnatante e risospendere in 750 μL di Tris-HCl 0,5 M + 750 μL di una soluzione di acetone e metanolo (rapporto a 5:2).
. Centrifugare di nuovo a 13.000 RPM per 5 minuti.
. Eliminare il surnatante e risospendere pellet in etanolo 95% in volume da eppendorf.
. Centrifugare di nuovo a 13.000 RPM per 5 minuti.
. Eliminare il surnatante e risospendere pellet in Tris-HCl in volume da eppendorf.
. Seccare il campione a 60 °C e conservarlo, se dupurato da impurezze, per ulteriori analisi.

*Si è anche provato ad aggiungere lisozima e SDS in quantità maggiori in alcuni campioni di lisato per tentare di eliminare tutti i residui di membrana.
**Alcuni surnatanti a volte sono stati filtrati sotto cappa con filtri da 0,22 μm o 0,45 μm per notare se veniva trattenuto materiale e, nel caso, stimarne le dimensioni.
B) Protocollo per separare il materiale con gradienti di saccarosio:

. Preparare una soluzione in acqua bidistallata EDTA 0,01 M e Tris-HCl 0,1 M in cui disciogliere il saccarosio.
. Aggiungere 20 mL di soluzione di saccarosio disciolto nei tubini in maniera lenta e accurata per evitare che i gradienti si mischino.
. Aggiungere in cima ai gradienti tutto il campione, lisato o integro, da separare.
. Centrifugare il gradiente in ultracentrifuga a 18.000 RPM, 4°C per 120 minuti.
. Le varie frazioni separate possono essere poi recuperate ed essere trattate come secondo il punto A.
. (Passaggio alternativo al punto A) centrifugare le frazioni in eppendorf 13.000 RPM, 2-3 minuti e risospendere in Tris-HCl 0,1 M. Ripetere 3 volte.

*Eventuali pellet da riesaminare sono stati conservati a −20°C.