Ruolo della fosfolipasi C in radici di riso sottoposte a stress anaerobico

La glutammato decarbossilasi (GAD) delle piante catalizza la conversione di L-glutammato ad acido g-aminobutirrico (GABA) mediante a-decarbossilazione. Negli animali GABA agisce come inibitore della trasmissione nervosa, aumentando la conduttanza dei canali di membrana per lo ione cloruro. Attualmente non ci sono prove di una sua simile azione di aumento di permeabilità di membrana nel regno vegetale.
Nelle piante superiori, GABA si accumula rapidamente in tessuti esposti a svariate condizioni di stress abiotico (termico, salino, meccanico, anossico, ecc.). I lavori in letteratura indicano che la GAD viene attivata da aumenti nei livelli citoplasmatici di H+ e Ca2+, e che accumulo di GABA può essere importante nelle regolazione del pH citoplasmatico.
E’ stato recentemente osservato che l’enzima fosfolipasi C (PLC) è coinvolto nell’attivazione del rilascio di Ca2+ che si osserva in alcune condizioni di stress abiotico. In questo lavoro di tesi, è stato indagato il ruolo della fosfolipasi C (PLC) nella catena di trasduzione del segnale anaerobico che porta all’accumulo di GABA, processo dipendente da Ca2+. La specie utilizzata è Oryza sativa (L. cv. Arborio). Il livello di GABA aumentava da 1,10 mmoli g-1 di peso fresco in condizioni aerobiche, a 3,09 mmoli g-1 di peso fresco dopo 3 ore di anaerobiosi. L’inibitore dei canali Ca2+ cADPR-sensibili (Ryanodina, un alcaloide da Ryania speciosa) non influenzava l’accumulo di GABA indotto da anossia, mentre l’inibizione avveniva con Rosso Rutenio 400 mM, un inibitore del rilascio di Ca2+ da comparti intracellulari. L’applicazione durante l’anaerobiosi di inibitori della PLC, Neomicina e composto 48/80 (C48/80), in scala di concentrazione crescente, dava come risultato una inibizione dell’accumulo anaerobico di GABA. L’accumulo di GABA veniva ripristinato dall’aggiunta di CaCl2 e A23187 (Ca2+ ionoforo). Questo ristabilirsi dell’accumulo di GABA dopo trattamento con CaCl2 indica che gli inibitori della PLC agiscono a monte del rilascio intracellulare di Ca2+. Se i germogli venivano pretrattati per due ore in condizioni aerobiche con AlF4- (un attivatore delle proteine G), questi mostravano un aumento dell’accumulo anaerobico di GABA del 43% rispetto a radici anaerobiche di controllo. L’accumulo di GABA in germogli pretrattati con AlF4- 200 mM era fortemente inibito dall’aggiunta di Neomicina o C48/80. E’ stato poi determinato il livello di inositolo1,4,5-trifosfato (IP3) in radici di germogli di riso sottoposti a trattamento anaerobico. Il livello aerobico di IP3 era di 33,7 pmoli g-1 di peso fresco e aumentava nei primi minuti di stress anaerobico. Dopo 5 minuti il livello di IP3 era 3,5 volte quello in aria e quindi cominciava a diminuire rimanendo comunque più alto che in aria (+64%). Il livello di IP3 è stato poi esaminato a 5 minuti di anaerobiosi dopo pretrattamenti con Neomicina, C48/80, AlF4- (200 mM), Ca2+ (2mM), AlF4-+Neomicina, AlF4-+C48/80, AlF4-+Ca2+. Entrambi gli inibitori della PLC inibivano l’aumento anaerobico di IP3, mentre la stimolazione delle proteine G mediante AlF4-, induceva un aumento di concentrazione di IP3 fino ad un livello superiore a quello anaerobico. Quest’ultimo effetto era completamente annullato da Neomicina o da C48/80. La presenza di Ca2+ riduceva la concentrazione di IP3 a livelli osservati in aria in radici anaerobiche trattate con AlF4-.
L’insieme di questi dati indica che la PLC agisce sulla via di trasduzione del segnale anaerobico in radici di riso. La PLC opererebbe a valle delle proteine G e il suo prodotto, l’IP3, è probabilmente il messaggero secondario coinvolto nel rilascio di Ca2+.