Gli Adenovirus
I secondi virus a circuito oro-fecale che prendiamo in considerazione sono gli Adenovirus, ed è il primo ciclo replicativo che esaminiamo di un DNA-virus.
Caratteristiche degli adenovirus
La replicazione degli adenovirus
Qua vediamo illustrato in maniera schematica il ciclo replicativo di questi DNA-virus. Ecco qua una particella di Adeno, ci sono queste fibre che si proiettano ai vertici e terminano con un ingrossamento che prende rapporto col recettore della cellula ospite, ma un solo recettore non è sufficiente, infatti il virus per potersi legare alla cellula richiede l’intervento di un secondo recettore che funge da “corecettore”, quindi, quando avviene questo incontro con i 2 recettori il virus riesce a penetrare per endocitosi, l’acidificazione a livello del lisosoma libera il virus nel citoplasma, questo si dirige verso il nucleo e finalmente viene localizzato il genoma a DNA, che potrà così essere trascritto per arrivare alla sintesi delle proteine virali; queste proteine serviranno per formare nuovi genomi e sintetizzare le proteine strutturali. Questi elementi assemblandosi danno origine a nuove particelle di Adenovirus.Sono virus che esprimono la propria informazione genetica in maniera temporalmente molto ordinata. È un virus che promuove tutta una serie di eventi che sono correlati tra di loro in successione.
Da un unico promotore vengono trascritti quei metageni che portano alla sintesi delle proteine tardive. Forma quindi 5 messaggeri tardivi “LATE”.
Quale è la caratteristica saliente della replicazione degli adenovirus? Una volta che da questi promotori si sono formati dei messaggeri, questi sottostanno ad un numero veramente elevato di splicing (fenomeno scoperto appunto negli adeno) e vedremo come questo splicing svolge un ruolo determinante per la sintesi di tutte le proteine necessarie per il suo ciclo replicativo. Ci sono altri 2 m-RNA “VA” che anziché essere trascritti dalla polimerasi di tipo 2 sono trascritti da quella di tipo 3, e trascrivono per proteine che sono molto importanti per gli attacchi del virus al sistema immuno-competente.
Ho fatto una sorta di introduzione alla diapositiva successiva:
I promotori precoci tardivi sono la proteina 4A2 che viene trascritta nella catena sinistra mentre l'altra proteina, 9, viene trascritta nella destra. A partire da un unico promotore, si ha l'avvio per la sintesi di tutti i messaggeri LATE che saranno poi proteine strutturali e sono caratterizzate da avere l'inizio tutte in questa stessa regione chiamata “leader”.
Quale è la proteina fondamentale che permette l'espressione degli adenovirus?
Questa proteina è la E1A; perché?
È l'unica che può essere trascritta solo da fattori di trascrizione cellulari, una volta che questo DNA entra nel nucleo della cellula, solo E1A può essere trascritto usando fattori cellulari e quindi di conseguenza quando questo DNA arriva nel nucleo avremo soltanto la formazione della proteina E1A. Se questa proteina non viene tradotta il virus non può esprimersi. Perché è cosi importante il suo ruolo?
Il virus va ad infettare delle cellule epiteliali, queste cellule sono sia cellule differenziate sia cellule quiescenti, cosa comporta questo? Il virus entra va a replicare nel nucleo ed ha estremo bisogno di collaborazione della cellula ospite per riuscire a replicare il proprio DNA. Una cellula quiescente non è pronta a replicare il DNA, è quindi in una fase di arresto; il virus trova quindi un ambiente cellulare che non corrisponde a quelle che sono le sue esigenze, e quale è il ruolo di E1A? È quello di dare un calcio alla cellula e dirgli di replicarsi per avere tutto quel materiale utile per la sua duplicazione. Quindi se non di esprime E1A la cellula non entra in fase S.
Con chi reagiscono queste proteine tramite i segmenti CR1 e CR2? Con questi segmenti, queste proteine sono in grado di reagire con la famiglia delle proteine pRb –p107 e p130 (retinoblastoma). Queste proteine Rb grazie alle porzioni CR1 e CR2 possono essere legate alla proteina E1A. Cosa succede? E perché è importante avviare la cellula in fase S? Quando una cellula è ferma la fase S è repressa proprio da una proteina Rb che lega il fattore E2F, fattore di trascrizione, che permette di trascrivere tutti quei geni che portano la cellula ad entrare in S, quindi dei determinanti importanti per promuovere la duplicazione del DNA.
In un ciclo cellulare normale Rb si lega al fattore E2F e tiene la cellula ferma in G0, l'ingresso in fase S è bloccato. Stimoli, fattori di crescita, inducono la cellula a riprendere il ciclo replicativo; ecco che una serie di trasmissioni del segnale portano ad attivare una ciclino-chinasi dipendente che ha il compito di fosforilare Rb, vedete qui il passaggio, e una volta che Rb è stata fosforilata E2F è libero di funzionare e quindi di attivare la trascrizione di quei geni che portano la cellula alla fase S.
A seguito del funzionamento dei fattori E2F, la cellula decide di prendere la via apoptotica, però è un rischio, infatti se anche la cellula muore, anche la replicazione del virus sarà inattivata e allora bisogna correre ai ripari… in che modo? Arginando, stoppando la via apoptotica. Abbiamo esaminato questo aspetto in cui il legame con Rb induce la cellula ad entrare in fase S; ma l'attività della proteina E1A non si limita a questo, infatti con la sua porzione CR3 (presente solo nella proteina 289R) è in grado di attivare altri trascritti virali che portano alle proteine E3 E4, mentre con la porzione CR1 e con la porzione N è in grado di legare delle proteine cellulari, p300 e CBP che sono delle acetiltransferasi. Cosa fanno alle proteine attivate dall'E1A? Sappiamo che gli istoni hanno il compito di staccare i promotori sul DNA e questo disturba la loro trascrizione, ostacola i legami dei fattori di attivazione della trascrizione al promotore, ecco che grazie al legame tra la proteina E1A a queste attività enzimatiche, le attiva, e il risultato è che gli istoni vengono acetilati, e così assumono una conformazione molto più lassa, che facilita il riconoscimento, o meglio la localizzazione sui promotori dei fattori di attivazione della trascrizione. Tutto quanto deve essere trascritto all' inizio della fase S, quindi abbiamo da una parte l'intervento su Rb, che dice alla cellula puoi entrare in S, e come può facilitare ulteriormente la formazione di trascritti che avvengono nella cellula all'inizio della fase S? Rende più lassi gli istoni grazie all'attivazione di proteine come CBP e p300, che acetilano gli istoni e rendono più facile la trascrizione.
• Questo succede perché la proteina E1A non fa volutamente tale processo, ma attiva vari trascritti che portano anche all'attivazione della proteina p53.
Come vanno le cose normalmente? Questa è la p53 che se attivata e se si accumula dice alla cellula prendi la via apoptotica. Una cellula normale va incontro a danneggiamento del DNA e ci sono tutta una serie di segnali accumulo e attivazione della p53 e apre la porta all'apoptosi. Come viene regolata normalmente la p53? Viene regolata da un’altra proteina chiamata MDM2. Infatti la p53 attiva la MDM2 che a sua volta si lega alla p53 e ne determina la degradazione nei proteasomi. In poche parole la MDM2 controlla la concentrazione di p53. A sua volta da chi è regolata la MDM2? È regolata da un'altra proteina che è la p14arf che si lega alla MDM2 , e in questa maniera MDM2 viene sequestrata e si avrà l’accumulo di p53.
Cosa succede quando la proteina E1A virale degli adeno libera il fattore E2F ?
Ricordate che E1A deve liberare questo fattore per indurre la cellula ad entrare in fase S e succede che induce anche la trascrizione della proteina p14, più proteina p14 viene prodotta, maggiore sarà il suo legame alla MDM2, e di conseguenza avremo accumulo della p53.
Quindi abbiamo visto che a causa della liberazione dei fattori di trascrizione viene anche indotto il gene della p53, quindi maggior sequestro della proteina MDM2, che ha come ultima conseguenza l'aumento della p53 che non viene degradata. Ma l’intervento di E1A non si limita a questo. E1A è capace di bloccare l’attivazione da parte di p53 della proteina MDM2, bloccando questa attivazione, il risultato sarà sempre quello di diminuire la concentrazione di MDM2 con conseguente accumulo di p53 e quindi segnale per la cellula di imboccare la via apoptotica. Agisce sia indirettamente che direttamente.
Ecco però che una seconda proteina entra in gioco ad aiutare il virus, la E1B e blocca la via apoptotica che involontariamente la E1A ha attivato; in questo modo il virus potrà mandare avanti il suo ciclo replicativo. Ancora una volta attraverso lo splicing, E1B viene divisa in più proteine e le più famose sono: 19K e 55K. Come fanno queste proteine a bloccare l’apoptosi? La 19K la sopprime in questa maniera: vi ho detto prima che Bax è un oligomero formato da tante proteine che si lega alla membrana del mitocondrio, il ruolo di E1B è quello di impedire la formazione di questi oligomeri, si lega a Bax e blocca la via apoptotica. L’altra proteina, la 55k, si lega alla p53 e ne reprime la trascrizione, quindi blocca la sua produzione. Ma non si limita a fare questo, ed insieme ad un’altra proteina virale la E4orf6 , fa si che la p53 venga velocemente degradata a livello dei proteasomi. Quindi questi 2 interventi diminuiscono drasticamente i livelli di p53, dall’altra parte la 19K ha evitato il contatto con Bax e la membrana del mitocondrio, quindi la cellula evita la via apoptotica e il virus realizza il suo intento.
Voi sapete che in un normale processo di duplicazione del DNA, in una delle catene la sintesi è continua e nell'altra catena è discontinua, con formazione di primer che poi verranno rimossi ecc.; gli adeno hanno scelto una strategia di replicazione del proprio DNA particolare, qui la vediamo schematizzata:
Ripartiamo dall'inizio: abbiamo una molecola bicatenaria di DNA virale, ad una estremità si lega la DNA polimerasi, neo sintetizzata,questa polimerasi utilizza un innesco proteico (proteina pre-terminale), questa espone un OH libero per formare un legame fosfodiesterico, segue l’aggancio della polimerasi che può iniziare a scorrere in maniera continua una delle due catene parentali, l’altra catena viene allontana e rivestita della proteina pre-terminale.
Quale è il risultato? La formazione di una catena di DNA neo sintetizzata (quella in arancione e quella scura è la parentale) e una catena parentale che è stata allontanata e rivestita dalla proteina pre-terminale specifica; però il virus ha copiato solo una catena e questo non è molto conveniente perché ha fretta di fare nuovi genomi da utilizzare per sintetizzare nuove particelle virali, quindi cosa succede? Il DNA degli adeno è caratterizzato dall'avere delle sequenze inversamente ripetute alle estremità, queste consentono a questa molecola di DNA di chiudersi agli estremi, si forma questa struttura che può ricordare una “padella con una manico”, perché è importante formare questa struttura? Questa zona forma una doppia catena che ricorda la porzione terminale del genoma virale, si ricrea una doppia catena di DNA che sarà riconosciuta dalla polimerasi, dalla proteina pre-terminale e si ripete quello che abbiamo visto all’inizio della sintesi del DNA; ed ecco che la polimerasi incontra un DNA bicatenario lo riconosce e comincia a copiare questo primo tratto bicatenario e il risultato che anche questa catena inizialmente spostata, viene copiata. Si sono formati due genomi distinti.
Cosa succede alla proteina innesco? Durante le fasi di maturazione del virus questa proteina pre-terminale viene clivata in una proteina più piccola chiamata proteina terminale che è legata all'estremità 5'di tutte e 2 le catene del genoma degli adeno.
Non finisce qui l’importanza di questo leader. Infatti una volta arrivati nel citoplasma saranno in competizione coi messaggeri cellulari, come vince la battaglia? Un ruolo fondamentale nella sintesi normale è svolto da fattori come eif -4f, abbiamo il 4e che riconosce il cappuccio, il fattore 4a e il 4g, concorrono tutti alla formazione del complesso iniziale della sintesi proteica, è richiesto un f-met, una subunità ribosomiale 40s , e una volta che si assembla il ribosoma può scorrere in uno stampo fino ad incontrare il primo AUG ed iniziare la sintesi.
Cosa fa il virus? Una serie di proteine degli adeno sono in grado di defosforilare il fattore 4f; una volta che è defosforilato i messaggeri cellulari perdono la possibilità di essere tradotti. Grazie all'avere un leader in 5’, i messaggeri virali riescono a superare questo blocco tra questo leader e la porzione18 s del ribosoma c’è infatti complementarietà, il leader si lega alla sub 40s e la sintesi proteica con stampo messaggeri virali riesce a procedere. I messaggeri cellulari sono bloccati e quelli virali liberi.
La risposta immunitaria agli adenovirus
Queste armi sono tante ed efficaci ma non inarrestabili. Il virus non vuole portare a morte l'ospite. Prima di tutto abbiamo la difesa contro l'interferon. Vi dicevo all'inizio che porzioni del DNA complementare stimolano la sintesi dell'interferon, quando la cellula viene avvisata da questa molecola, sintetizza una proteina chinasi RNA dipendente (PKR) che viene attivata. Come contrasta l'azione della PKR? Con una proteina trascritta dall'RNA-pol III che ha il compito di legarsi alla PKR, inattivandola; se questa viene inattivata il fattore EIF 2 potrà seguire il proprio ciclo che porta alla trifosforilazione del GTP e la sintesi proteica non viene alterata. Quindi il ruolo della proteina che chiamiamo VA è quello di legarsi alla PKR inattivare questa chinasi e rendere possibile il normale procedere delle sintesi proteiche delle cellule virus infette.
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Dettagli appunto:
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Autore:
Simone Pisu
[Visita la sua tesi: "Caratterizzazione molecolare ed eterogenicità delle varianti emoglobiniche in Sardegna"]
- Università: Università degli Studi di Cagliari
- Facoltà: Biologia
- Corso: Biologia Cellulare e Molecolare
- Esame: Virologia molecolare
- Docente: Prof. Marongiu
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