Diagnosi della distribuzione quantitativa di Leishmania infantum in diversi distretti tissutali tramite Real Time PCR Comparazione di metodologie come contributo alla standardizzazione di un metodo Real Time PCR per la diagnosi di leishmaniosi

Il DNA estratto è stato amplificato utilizzando SYBR Green PCR Master Mix (Diatheva, s.r.l., Italy). Il kit è molto sensibile e facile da usare; il vantaggio consiste nel legame non specifico del colorante SYBR Green I al solco minore della doppia elica di DNA, che lo rende versatile per qualsiasi target; sono richiesti solo i primers specifici e nessuna progettazione di una sonda di ibridazione. Di conseguenza, questo sistema riduce i costi e dà maggiore flessibilità sperimentale.

All'inizio del processo di amplificazione, la miscela di reazione contiene il DNA denaturato, i primers e la molecola fluorescente. Dopo l'annealing dei primers, si legano poche molecole fluorescenti alla doppia elica. Durante l'elongazione si verifica un aumento di fluorescenza che aumenta parallelamente all'aumento del numero di copie dell'amplicone con il susseguirsi dei cicli di PCR. La molecola fluorescente si lega in modo random a tutte le doppie eliche, inclusi i dimeri di primers. È necessario pertanto ottimizzare la metodica per evitare la formazione di prodotti aspecifici. Dopo l'amplificazione, i campioni sono riscaldati e la variazione dell'energia di fluorescenza viene monitorata per generare una curva di dissociazione. [...]