La serina proteasi

Le serina proteasi sono forse la classe di enzimi meglio conosciuta. Questi enzimi proteolitici hanno un meccanismo catalitico comune che si basa su di un residuo di Ser particolarmente reattivo ed essenziale per la loro attività enzimatica. Le serina proteasi meglio caratterizzate sono: la chimotripsina, la tripsina e l'elastasi.
CINETICA E GRUPPI CATALITICI
La chimotripsina, la tripsina e l'elastasi sono enzimi digestivi che vengono sintetizzati nel pancreas. Tutti e tre questi enzimi catalizzano l'idrolisi di legami peptidici, ma con diverse specificità per le catene laterali che affiancano il legame peptidico che deve essere rotto. (L'insieme di questi enzimi forma un potente succo digestivo). Studi cinetici sull'idrolisi catalizzata dalla chimotripsina del p-nitrofenilacetato hanno dimostrato che la reazione avviene in due fasi: 1) la “fase esplosiva” in cui si forma molto rapidamente il p-nitrofenolato (si colora intensamente), 2) la “fase lenta e costante” o stazionaria in cui il p-nitrofenolato viene generato a velocità ridotta rispetto alla prima fase, ma costante nel tempo. Queste osservazioni sperimentali possono essere interpretate nei termini di una sequenza di due reazioni in cui (1) l'enzima prima reagisce rapidamente con il p-nitrofenilacetato rilasciando p-nitrofenolato e formando un intermedio covalente acil-enzima, che (2) viene lentamente idrolizzato a enzima libero e acetato. La chimotripsina segue quindi un meccanismo a ping pong. In altre parole l'enzima lega rapidamente il substrato e rilascia il 1° prodotto, il p-nitrofenolato, ma il 2° prodotto, lo ione acetato, viene rilasciato molto lentamente. Quindi la formazione di p-nitrofenolato è più rapida all'inizio (fase esplosiva), ma tende a diminuire man mano che si accumula l'acil-enzima fino a che non diventa uguale a quella di rilascio dello ione acetato (fase stazionaria).      
STRUTTURA AI RAGGI X
La chimotripsina, la tripsina e l'elastasi sono enzimi strettamente omologhi, infatti, le strutture primarie di questi enzimi sono identiche per circa il 40%. Tutti questi enzimi hanno una Ser attiva e una His cataliticamente essenziale, oltre a meccanismi cinetici simili. Non è quindi sorprendente che queste proteine risultino simili anche all'analisi della loro diffrazione dei raggi X. Tutte e tre queste proteine sono ripiegate in due domini, i quali contengono estese regioni a β-struttura antiparallela; le regioni in α-elica sono, invece, molto limitate. I residui cataliticamente essenziali His 57 e Ser 195 sono localizzati nel sito che lega il substrato insieme ad un altro residuo, l'Asp 102, che è immerso in una tasca inaccessibile al solvente. Questi tre residui formano una triade catalitica, collegata da legami idrogeno.
SERINA 195—LEGAME H—ISTIDINA 57—LEGAME H—ASPARTATO 102
Come sappiamo, le omologie strutturali e di sequenza tra le proteine sono un segnale delle loro relazioni evolutive. Le grandi somiglianze che esistono tra la chimotripsina, la tripsina e l'elastasi indicano che le tre proteine si sono evolute mediante duplicazione del gene di una serina proteasi ancestrale, seguita poi da una evoluzione divergente degli enzimi così formati. Ulteriori informazioni sulle relazioni evolutive tra le serina proteasi sono derivati dallo studio di una serina proteasi di origine batterica, la subtilisina. Questa è una serina proteasi la cui struttura primaria e terziaria non presenta relazioni visibili con quelle della chimotripsina, ma studi hanno dimostrato che i gruppi catalitici del sito attivo di questo enzima sono essenzialmente identici a quelli delle altre tre serina proteasi e sono organizzati nello spazio esattamente nello stesso modo. Poiché l'ordine dei residui catalitici nella sequenza è notevolmente diverso tra la subtilisina e le altre serina proteasi pancreatiche, sembra molto improbabile che anche questo enzima si sia evoluto dallo stesso gene ancestrale. La chimotripsina e la subtilisina costituiscono apparentemente un esempio di evoluzione convergente: sembra che la natura abbia scoperto lo stesso meccanismo catalitico almeno due volte.
MECCANISMO CATALITICO
La considerevole omologia strutturale dei siti attivi delle serina proteasi implica che anche i meccanismi catalitici siano simili. È stato, infatti, formulato il seguente meccanismo catalitico per le serina proteasi(qui riferito alla chimotripsina):
1.dopo che la chimotripsina ha legato il substrato, la Ser 195 attacca nucleofilamente il gruppo carbonilico del legame suscettibile per formare un intermedio tetraedrico (catalisi covalente). Studi ai raggi X hanno dimostrato che la Ser 195 è in una posizione ideale per condurre questo attacco nucleofilo (effetto prossimità e orientamento);
2.l'anello imidazolico dell'His 57 lega il protone che si libera formando uno ione imidazolico (catalisi basica generale);
3.questo processo è aiutato dall'effetto polarizzato del gruppo carbossilico ionizzato non idratato dell'Asp 102, che forma un legame idrogeno con l'His 57 (catalisi elettrostatica);
4.l'His 57 dona un protone (catalisi acida generale) e l'intermedio tetraedrico si decompone nell'intermedio acil-enzima;
5.il gruppo amminico che si viene a formare (R'NH2, il nuovo ammino-terminale della catena polipeptidica rotta) viene rilasciato dall'enzima e sostituito con una molecola d'acqua presa dal solvente;
6.la deacilazione, infine, avviene con un meccanismo inverso a quello di formazione dell'intermedio: l'acqua agisce da nucleofilo che attacca e la Ser 195 è il gruppo che se ne va, il gruppo carbossilico viene rilasciato dall'enzima e quest'ultimo libero viene anch'esso rilasciato.