Sequenze delle catene polipeptidiche

SEPARAZIONE E PURIFICAZIONE DEI FRAMMENTI PEPTIDICI
A questo punto, ancora una volta dobbiamo usare tecniche di separazione per isolare i frammenti peptidici, generati dal processo di rottura specifica, per le successive operazioni di sequenziazione. Molto spesso arrivati a questa fase si utilizza la cromatografia in fase inversa in HPLC.
DETERMINAZIONE DELLA SEQUENZA
Una volta ottenuti i frammenti peptidici della lunghezza corretta è possibile determinare la sequenza. Il modo migliore è quello di ripetere ciclicamente la degradazione di Edman grazie ad un apparecchiatura nota con il nome di sequenziatore a coppa rotante. Questo strumento contiene una coppa di vetro rotante ad una velocità da 1000 a 4000 giri per minuto, sulla cui superficie interna è immobilizzato il peptide sotto forma di film sottile. In un tipo diverso di apparecchio detto sequenziatore in fase solida il peptide è invece legato covalentemente ad un supporto solido inerte. Negli strumenti più avanzati, invece, il peptide è immerso in un sale amminico quaternario polimerico, il polibrene, che immobilizza il peptide, ma allo stesso tempo è facilmente penetrabile ai reagenti di Edman (trasportati sotto forma di vapore in un flusso di Argon). In tutti questi strumenti, quantità accuratamente misurate dei vari reagenti vengono aggiunte nella cella di reazione ad intervalli programmati. A questo punto i derivati tiazolinone-amminoacidi vengono rimossi automaticamente, convertiti nei corrispettivi PTH-amminoacidi e identificati per cromatografia. Queste apparecchiature sono in grado di identificare più di un residuo per ora.