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Sviluppo e caratterizzazione di un Adenovirus oncolitico replicativo dipendente dal micro-RNA-199 per la Terapia dell'epatocarcinoma

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________________________________________________________________________________ 1 INDICE RIASSUNTO………………………………………………………………………… 4 INTRODUZIONE…………………………………………………………………... 5 Il carcinoma epatocellulare……………………………………………………………. 5 1. Terapie contro HCC ………………………………………………………………….. 7 I microRNA………………………………………………………….............................. 10 1. Regolazione dell’espressione genica………………………………………………….. 13 1.1. Riconoscimento target………………………………………………………….... 13 1.2. Meccanismi di funzionamento…………………………………………………… 13 2. Ruolo biologico……………………………………………………………………….. 14 3. miRNA e Cancro……………………………………………………………………… 16 3.1 Cause dell’espressione aberrante miRNA……………………………………….. 18 3.1.1. Collocazione miRNA in ragioni genomiche associate a cancro…………… 18 3.1.2. Regolazione epigenetica dell’espressione dei miRNA…………………… 19 3.1.3. Anomalie nei geni e nelle proteine per il processamento miRNA………… 19 3.2. Conseguenze dell’alterata espressione dei miRNA……………………………… 20 3.3. I miRNA e la biologia tumorale………………………………………………… 22 4. miRNA come target diagnostici e prognostici………….…………………………….. 25 5. miRNA come target terapeutici…….…………………………………………………. 26 I microRNA e il carcinoma epatocellulare…….……………………………………… 28 1. Il miR-199…………………………………………………………………………….. 30 La Terapia Genica……………………………………………………………………… 34 1. Vettori adenovirali……………………………………………………………………. 35 2. La terapia genica del cancro al fegato………………………………………………… 39 2.1. La terapia con geni suicidi……………………………………………………… 41 SCOPO DELLO STUDIO……………………………………………………….. 43 MATERIALI E METODI………………………………………………………… 44 1. Batteri…………………………………………………………………………………. 44 ________________________________________________________________________________ 2 1.1. Ceppo batterico……………………...................................................................... 44 1.2. Terreni per colture batteriche…………………………………………………… 44 1.3. Preparazione delle piastre di terreno semi-solido……………………………….. 44 1.4. Antibiotici per la selezione……………………………………………………… 44 1.5. Preparazione di cellule di E. coli competenti……………………………………. 45 1.6. Trasformazione di cellule di E. coli…………………………………………….. 45 1.7. Congelamento cellule batteriche………………………………………………… 46 2. Metodologie Ricombinanti…………………………………………………………… 47 2.1. Vettori…………………………………………………………………………… 47 2.2. Elettroforesi su gel d’agarosio e purificazione di DNA………………………… 48 2.3. Reazione di ligazione……………………………………………………………. 50 2.4. Enzimi di restrizione…………………………………………………………….. 50 2.5. Amplificazione e purificazione DNA plasmidico………………………………. 51 2.5.1. Inoculi…………………………………………………………………….. 51 2.5.2. Purificazione del DNA plasmidico da cellule batteriche…………………. 51 2.6. PCR (Polimerase Chain Reaction)……………………………………………… 51 2.7. Estrazione di RNA da cellule…………………………………………………… 53 2.8. RT-PCR con random primers………………………………………………….. 54 2.9. Real Time PCR (EVA Green)………………………………………………… 55 2.10. RT-PCR per MicroRNA……………………………………………………… 56 2.11. Real Time PCR con TaqMan MicroRNA Assays……………………………… 57 3. Colture Cellulari……………………………………………………………………… 58 3.1. Linee cellulari…………………………………………………………………… 58 3.2. Passaggio cellule………………………………………………………………... 58 3.3. Conta cellulare…………………………………………………………………… 58 3.4.Congelamento cellule…………………………………………………………….. 59 3.5. Transfezione con Lipofectamina………………………………………………… 59 3.6. Raccolta cellulare per successiva estrazione dell’RNA o del DNA…………… 60 ________________________________________________________________________________ 3 4. Sistema Adenovirale………………………………………………………………….. 61 4.1. Caratteristiche Adenovirus e vettori adenovirali………………………………… 61 4.2. Costruzione vettore adenovirale…………………………………………………. 62 4.2.1. Ricombinazione…………………………………………………………… 62 4.2.2. Analisi dei cloni positivi…………………………………………………… 64 4.3. Produzione del virus……………………………………………………………... 64 4.4. Raccolta stock primario dell'adenovirus………………………………………… 65 4.5. Amplificazione dell’adenovirus………………………………………………… 65 4.6. Concentrazione dello stock adenovirale…………………………………………. 65 5. Inoculazione virus in vivo…………………………………………………………….. 65 RISULTATI………………………………………………………………………….. 67 1. Creazione del vettore di entrata pENTR–E1A/199T/E1B-TK/199T…………………. 68 1.1. Costruzione del vettore intermedio pENTR–E1A/199T/E1B…………………… 68 1.2. Costruzione del vettore di entrata pENTR-E1A/199T/E1B-TK/199TK………… 70 2. L’espressione della TK nel vettore di entrata è miR199-dipendente…………………. 73 3. Produzione dell’Adenovirus oncolitico selettivamente replicativo Ad199T/TK199…. 75 3.1 Sviluppo del vettore adenovirale pAd199T/TK199T…………………………….. 75 3.2 Produzione dell’Adenovirus replicativo Ad199T/TK199T………………………. 79 3.3. Amplificazione e titolazione dell’Adenovirus Ad199T/TK199T……………….. 80 4. Test di replicazione virale dell’Adenovirus oncolitico ……………………………… 82 4.1. La replicazione dell’adenovirus Ad199T/TK199T è dipendente dal miR-199 in vitro……………………………………………………………………………………………. 82 4.2. La replicazione dell’adenovirus Ad199T/TK199T è dipendente dal miR-199 in vivo……………………………………………………………………………………………… 84 DISCUSSIONE……………………………...………………………………………. 86 BIBLIOGRAFIA……………..……………………………………………………... 90
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Informazioni tesi

  Autore: Gaia Nellini
  Tipo: Laurea liv.II (specialistica)
  Anno: 2011-12
  Università: Università degli Studi di Ferrara
  Facoltà: Farmacia
  Corso: Biotecnologie mediche, veterinarie e farmaceutiche
  Relatore: Massimo Negrini
  Lingua: Italiano
  Num. pagine: 98

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Parole chiave

terapia genica
microrna
terapia epatocarcinoma
vettori adenovirali
virus oncolitici

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