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Caratterizzazione della SHMT dal batterio psicrofilo Psychromonas Ingrahamii e confronto con l'enzima omologo da E. coli

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Indice 1. INTRODUZIONE 1.1 Gli organismi psicrofili 1 1.2 Generalità sulla serina idrossimetiltrasferasi 3 1.2.1 Il piridossale 5’-fosfato: struttura e biosintesi 5 1.2.2 Gli enzimi dipendenti dal piridossale 5’ fosfato: classificazione ed evoluzione 10 1.2.3 Struttura dell’SHMT 14 1.2.4 Proprietà catalitiche dell’SHMT 15 1.3 La serina idrossimetiltrasferasi da Psychromonas ingrahamii 20 1.4 Scopo della tesi 21 2. MATERIALI E METODI 2.1 Vettori plasmidici e ceppo batterico 23 2.2 Terreno di coltura 25 2.3 Tecniche del DNA ricombinante 25 2.3.1 Tecniche di clonaggio del DNA 25 2.3.2 Purificazione del DNA plasmidico 27 2.3.3 Elettroforesi su gel di agarosio 28 2.3.4 Purificazione del DNA da gel di agarosio 29 2.4 Preparazione delle cellule competenti 30 2.5 Trasformazione delle cellule competenti 31 2.6 Controllo dell’espressione della proteina 32 2.7 Tecniche di purificazione della proteina 2.7.1 Precipitazione frazionata 32 2.7.2 Purificazione su colonna cromatografica NiN-TA 33 2.7.3 Dialisi 35 2.8 Elettroforesi su gel di poliacrilammide in SDS (SDS-PAGE) 35 2.9 Preparazione dell’apoenzima 38 2.10 Studi cinetici 39 2.10.1 Analisi spettroscopica ed analisi dei dati cinetici 42 2.11 Studi di spettroscopia di fluorescenza 42 2.12 Cristallizzazione della proteina e raccolta dei dati 44 2.13 Analisi computazionale della sequenza e della struttura 45 3. RISULTATI 3.1. Costruzione del plasmide di espressione pET22b::piSHMT 47 3.2 Espressione e purificazione della piSHMT 48 3.3 Determinazione dei parametri cinetici 52 3.4 Studi di spettroscopia di fluorescenza dell’apoenzima e determinazione della costante di dissociazione (K d ) per il PLP 53 3.5 Determinazione della struttura dell’apo-piSHMT e modellizzazione dell’olo-piSHMT 56 4. DISCUSSIONE 66 5. BIBLIOGRAFIA 71
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Informazioni tesi

  Autore: Angela Di Bello
  Tipo: Laurea liv.II (specialistica)
  Anno: 2013-14
  Università: Università degli Studi di Roma La Sapienza
  Facoltà: Scienze Matematiche, Fisiche e Naturali
  Corso: Biologia
  Relatore: Stefano Pascarella
  Lingua: Italiano
  Num. pagine: 77

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Parole chiave

metabolismo
cristallografia
plp
shmt
psicrofilo
apoenzima
affinità cofattore
proprietà cinetiche
tetraidrofolato
struttura tridimensionale

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