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Risposte immunitarie nei vertebrati ectotermi: attività cellulari e molecolari di leucociti del Teleosteo Dicentrarchus labrax

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I INDICE CAPITOLO 1: IL SISTEMA IMMUNITARIO...……………………………...….pag 1 1. L’origine del sistema immunitario nei Vertebrati..…….……………………...…pag 1 1.2 IL SISTEMA IMMUNITARIO DEI TELEOSTEI.…….………………...……..pag 8 1.2.1 Sistema immunitario innato……………………………………………………..pag 10 1.2.2 Componenti della risposta immunitaria innata………………………………….pag 11 • Peptidi antibatterici……………………………………………………….pag 11 • Il complemento………………………………………………………....….pag 13 • Pentraxine………………………………………………………………....pag 15 • Lectine……………………………………………………………………..pag 15 • Lisozima………………………………………………………………….. pag 16 • Cellule citotossiche non specifiche (NCC)………………………………..pag 16 • La fagocitosi………………………………………………………………pag 17 • Le citochine dell’immunità innata………………………………………...pag 18 • Gli IFNs…………………………………………………………………...pag 20 • L’interleuchina-1 ed altre citochine pro-infiammatorie(ILs)……………..pag 21 • Il fattore della necrosi tumorale-α (TNF-α)…………………..……….….pag 24 • Le chemochine…………………………………………………………….pag 25 1.2.3 Sistema immunitario adattativo…………………………………………………pag 26 1.2.4 Immunità cellulo-mediata……………………………………………………….pag 28 • Citotossicità cellulo-mediata (CMC)……………………………………...pag 29 • Recettore delle cellule T (TcR)…………………………………………….pag 31 • Geni che attivano la ricombinazione (RAGs)……………………………..pag 31 • Geni MHC…………………………………………………………………pag 32 1.2.5 Co-recettori coinvolti nell’attivazione delle cellule T…………………………..pag 33 • Corecettore CD4…………………………………………………………..pag 34 • Corecettore CD8…………………………………………………………..pag 34 • Il corecettore CD45………………………………………………………..pag 35 II 1.2.6 Immunità umorale….……………………………………………………………pag 36 1.3 ORGANI LINFOIDI NEI TELEOSTEI………………………………………….pag 38 • Timo………………………………………………………………………..pag 39 • Rene………………………………………………………………………..pag 41 • Milza……………………………………………………….………………pag 41 1.3.1 Sistema immunitario associato alle mucose…………………..……………….pag 42 • GALT………………………………………………………………………pag 44 • SALT ………………………………………………………………………pag 44 • GIALT……………………………………………………………………...pag 45 1.4 L’ACQUACOLTURA…………………………………………………………….pag 46 1.4.1 L’acquacoltura in Italia…………………………………………………………..pag 48 1.4.2 Prevenzione delle patologie in acquacoltura: vaccini ed immunostimolanti …...pag 49 1.5 BIOLOGIA DELLA SPECIE MODELLO: Dicentrarchus Labrax L…...……….pag 54 • Riproduzione………………………………………………………………pag 55 CAPITOLO 2 : MATERIALI E METODI…...…………………………………...pag 57 2.1 Prelievo di organi e preparazione di colture leucocitarie…………………………pag 57 2.2 Purificazione dei Leucociti dalle branchie………………………………………..pag 58 2.3 Anticorpi monoclonali impiegati nella sperimentazione………………………….pag 58 2.4 PRODUZIONE DELL’ANTICORPO MONOCLONALE DLT22 CONTRO MARCATORI DI SUPERFICIE DELLE CELLULE T……………………………...pag 59 2.4.1 Terreno di coltura per ibridomi………………………………………………..pag 59 2.4.2 Antigene utilizzato per l’immunizzazione…………………………………….pag 59 2.4.3 Immunizzazione, prelievo della milza e processamento degli splenociti……..pag 59 2.4.4 Fusione……………………...………………………………………………...pag 60 2.4.5 Screening degli ibridomi.….………………………………………………......pag 61 2.4.6 Immunofluorescenza indiretta (IIF)……………………………………….......pag 61 III 2.4.7 Elettroforesi e western blotting…………………………………………….….pag 62 2.4.8 Immunoprecipitazione....……………………………………………………...pag 63 2.4.9 Saggi di immunoistochimica……………………………………………….....pag 63 2.4.10 Identificazione proteica mediante nano-RP-HPLC-ESI-MS/MS……...……..pag 64 2.5 IL CLONAGGIO……………………………………………………………...pag 65 2.5.1 Vettori utilizzati……………………………………………………………….pag 65 2.5.2 Microrganismo utilizzato………………………………………………....…...pag 66 2.5.3 Terreni di coltura…………………………………………………………...…pag 66 2.5.4 Elettroforesi del DNA su gel d’agarosio………………………………….…...pag 67 2.5.5 Purificazione di leucociti di spigola…………………………………………..pag 67 2.5.6 Estrazione dell’RNA totale……………………………………………………pag 67 2.5.7 Sintesi del cDNA……………………………………………………………...pag 68 2.5.8 Purificazione del DNA dal gel d’agarosio…………………………………….pag 68 2.5.9 Ligazione di frammenti di DNA…..…………………………………………..pag 69 2.5.10 Trasformazione delle cellule competenti…………………………………...…pag 69 2.5.11 PCR colony……………………………………………………………………pag 70 2.5.12 Colture batteriche...…………………………………………………………...pag 71 2.5.13 Estrazione del DNA plasmidico………………………………………………pag 71 2.5.14 Analisi di sequenza………………………………………………….………...pag 71 2.6 Clonaggio parziale cDNA del CD45 di spigola (Dicentrarchus labrax L.). ....pag 71 2.7 Analisi d’espressione mediante Q-PCR……………………………….……...pag 73 2.8 Studio dell’espressione basale del gene CD45 mediante real time-PCR.…….pag 79 2.9 Analisi di espressione del gene CD45 dopo stimolazioni “in vitro”…………pag 80 2.10 Studio dell’espressione di geni T specifici nelle branchie dopo stimolazione “in vitro”………………………………………………………………………….pag 81 2.11 ANALISI STATISTICA……………………………………………………...pag 82 2.12 SAGGI DI PROLIFERAZIONE “IN VITRO” DI LEUCOCITI……………..pag 82 2.13 Immunofluorescenza indiretta (IIF)…………………………………………..pag 83 2.14 Immunopurificazione magnetica con DLT15………………...………………pag 84 IV 2.15 Immunopurificazione magnetica con DLIg3…………………………………pag 85 2.16 Analisi d’espressione di tipo semiquantitativo……………………………….pag 86 CAPITOLO 3 : RISULTATI…..…....................………………………….………...pag 87 3.1 PRODUZIONE DELL’ANTICORPO MONOCLONALE DLT2………………..pag 87 3.2 IMMUNOFLUORESCENZA ED IMMUNOISTOCHIMICA…….……………..pag 87 3.3 WESTERN BLOTTING………………….………………………………………pag 87 3.4 Clonaggio parziale cDNA del CD45 di spigola (Dicentrarchus labrax L.)……...pag 92 3.5 PCR QUANTITATIV A…………………………………………………………...pag 95 3.5.1 Analisi d’espressione basale del gene CD45…...………...…..…………………pag 95 3.5.2 Analisi di espressione del gene CD45 dopo stimolazioni “in vitro”…………....pag 98 3.6 Espressione del gene CD45 nelle cellule T e B......……………………..……....pag 99 3.7 PROLIFERAZIONE DEI LEUCOCITI…....………………………………….pag 101 3.7.1 DLT 22 e proliferazione degli splenociti……...…...…………………………..pag 101 3.7.2 DLT15 e proliferazione degli splenociti…...……...……..……………………..pag 103 3.7.3 DLT15-DLT22 e proliferazione dei leucociti delle branchie…...…………..…pag 105 3.8 Analisi d’espressione di geni T specifici nelle branchie dopo stimolazione “in vitro”……………..………………………………………………………………pag 112 CAPITOLO 4 : DISCUSSIONE E CONCLSIONI…..……………………….....pag 116 BIBLIOGRAFIA…………………………………………………………………...pag 132 PUBBLICAZIONI
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Informazioni tesi

  Autore: Catia Marozzi
  Tipo: Tesi di Dottorato
Dottorato in Dottore di ricerca in Genetica e Biologia Cellulare
Anno: 2013
Docente/Relatore: Giuseppe Scapigliati
Correlatore: FrancescoBuonocore
Istituito da: Università degli Studi della Tuscia
Dipartimento: DIBAF
  Lingua: Italiano
  Num. pagine: 194

FAQ

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Parole chiave

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spigola
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