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Distruzione selettiva di cellule linfomatose CD22+ mediante targeting molecolare della saporina-S6

Le immunotossine sono molecole chimeriche composte da una porzione tossica legata ad una porzione vettore, che ne permette il direzionamento specifico su cellule bersaglio. Tra le tossine più frequentemente utilizzate per la preparazione di immunotossine vi sono le RIP (Ribosome Inactivanting-Protein), proteine in grado di bloccare la sintesi proteica cellulare deadenilando l’rRNA 28S in una posizione conservata e causando la morte cellulare. Come vettore vengono generalmente utilizzati anticorpi o loro frammenti.
Il CD22 è una proteina transmembrana espressa dall’85% delle neoplasie a cellule B. Essendo presente esclusivamente sui linfociti B maturi, questo antigene rappresenta un buon candidato per un utilizzo per l’immunoterapia.
Questa tesi descrive la realizzazione di un’immunotossina specifica per l’antigene CD22, ottenuta mediante coniugazione chimica dell’anticorpo monoclonale umanizzato hLL2 con la RIP monocatenaria saporina-S6, la cui attività antitumorale è stata valutata in linee cellulari di derivazione ematologica.
L’anticorpo hLL2, scelto per la costruzione di questa immunotossina è un anticorpo umanizzato già impiegato in sperimentazione clinica per la terapia di linfomi non Hodgkin a cellule B. L’utilizzo di un anticorpo umanizzato, anziché murino, comporta vantaggi legati sia alla diminuzione dell’immunogenicità, sia a migliori caratteristiche farmacologiche in vivo.
La saporina-S6 è una RIP di tipo 1 largamente utilizzata per la preparazione di immunotossine, che presenta buona resistenza ai processi di derivatizzazione e coniugazione, una scarsa tossicità aspecifica e un’alta attività catalitica una volta penetrata nel citoplasma.
Mediante un saggio di inibizione della sintesi proteica cell-free, costituito da un sistema di lisato di reticolociti di coniglio, è stato dimostrato che l’attività catalitica della saporina–S6 rimane elevata anche in seguito alla derivatizzazione e alla coniugazione, con un IC50 nell’ordine di 10-10 M. Mediante SDS-PAGE è stata valutata la composizione qualitativa e quantitativa dell’immunotossina prodotta. Dall’analisi è risultata la presenza di coniugato contenente una molecola anticorpale e una o più molecole di RIP, e la percentuale di anticorpo non coniugato è stata mantenuta limitata, entro circa il 20%.
L’attività citotossica dell’immunotossina hLL2/SO6 è stata valutata su linee cellulari di origine ematologica CD22+ mediante tre differenti saggi di citotossicità in vitro: inibizione della sintesi proteica cellulare, vitalità cellulare mediante determinazione chemiluminescente dell’ATP cellulare ed inibizione della capacità clonogenica.
L’immunotossina hLL2/SO6 stata in grado di bloccare completamente la sintesi proteica in tutte le linee bersaglio utilizzate: BJAB, REH, RAMOS, RAJI e D430B. La linea cellulare più sensibile è risultata la BJAB la cui sintesi proteica è stata completamente inibita già alla concentrazione di immunotossina pari a 10-10 M. Nella linea cellulare JURKAT CD22- l’immunotossina non ha avuto effetti tossici significativamente differenti da quelli della saporina-S6 non coniugata. Dalle curve di inibizione è stata calcolata, mediante regressione lineare, l’IC50 dell’immunotossina che è risultata nell’ordine di 10-11 M per tutte le linee cellulari; la saporina-S6 nativa, nelle stesse condizioni sperimentali, ha provocato un’inibizione della sintesi proteica molto minore, con IC50 nell’ordine di 10-8 M. La tossicità della RIP nei confronti delle cellule CD22+ è stata quindi aumentata di almeno tre ordini di grandezza in seguito al legame con hLL2.
Mediante determinazione dell’ATP cellulare è stato osservato che, in seguito al trattamento con l’immunotossina, la vitalità cellulare è diminuita drasticamente causando l’eliminazione totale delle cellule BJAB e REH trattate, rispettivamente a concentrazioni di immunotossina pari a 10-9 M e 10-8 M. Alle concentrazioni considerate in questo saggio la saporina-S6 non ha avuto effetti tossici significativi.
Infine è stato condotto un saggio di inibizione della capacità clonogenica cellulare sulle linee cellulari BJAB e REH. In questo saggio le cellule sono state incubate per un tempo minore (3 ore) con l’immunotossina hLL2/SO6, ma l’immunotossina è risultata comunque molto attiva, riuscendo ad abolire totalmente la capacità clonogenica delle cellule BJAB e a diminuire dell’84% quella delle cellule REH.
Dai risultati preliminari ottenuti, l’immunotossina hLL2/SO6 sembrerebbe essere idonea all’utilizzo per la terapia di linfomi non Hodgkin a cellule B tuttavia, prima di poterne ipotizzare un reale utilizzo in clinica, saranno necessari ulteriori studi su colture primarie e studi in vivo su modelli animali. Il prossimo passo sarà valutare la tossicità dell’immunotossina hLL2/SO6 verso i precursori midollari CD34+ e, se come atteso l’immunotossina non risulterà tossica, sarà possibile proporne l’utilizzo ex vivo per il purging del midollo osseo nel trapianto autologo di midollo.

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ABBREVIAZIONI 2,6Siα acido sialico legato α2,6 2-IT 2-iminotiolano 2-ME 2-mercaptoetanolo ADCC Antibody Dependent Cell-mediated Cytotoxicity (citotossicità cellulo-mediata anticorpo-dipendente); ADC Antibody-Directed Catalysis ADEPT Antibody-Directed Enzyme Prodrug Therapy APC Antigen Presenting Cell ATP Adenosin-trifosfato BCG Bacillo di Calmette-Guérin CD Cluster of Differentiation CDC Complement-Dependent Cytotoxicity (Citotossicità Complemento-Dipendente) CDR Complementarity Determining Regions CSF Colony Stimulating Factor CTL Cytotoxic T-Lymphocytes (Linfociti T Citotossici) dgA deglycosylated ricin A-chain (catena A della ricina deglicosilata) DOTA Acido 1,4,7,10-tetraazociclododecano- N,N',N",N"-tetraacetico dsFV disulphide Fv DT Tossina Difterica EBV Virus di Epstein-Barr EF-2 Elongation Factor 2 ELLMAN (reagente di) Acido 5,5'-ditiobis-(2- nitrobenzoico) Fab' Frammento antigen binding Fc Frammento cristallizabile FDA Food and Drug Administration Fv Frammento variabile GM-CSF Granulocyte-Macrophage Colony- Stimulating Factor GPI Glicosilfosfatidilinsitolo HAMA Human Anti-Mouse Antibody HL Hodgkin Lymphoma (Linfoma di Hodgkin) HMW High Molecular Weight (alto peso molecolare) IC 50 Concentrazione inibente il 50% IC 90 Concentrazione inibente il 50% IFN Interferone Ig Immunoglobulina IL Interleuchina IT Immunotossina ITIM Immunoreceptor Tyrosine-based Inhibitory Motif LAK Lymphokine Activated Killer LMW Low Molecular Weight (basso peso molecolare) mAb Anticorpo monoclonale MHC Complesso maggiore di istocompatibilità MW Molecular Weight (peso molecolare) NHL Non Hodgkin Lymphoma (Linfoma Non Hodgkin) NK Natural Killer PAGE poliacrilamide gel-elettroforesi PAP pokeewed antiviral protein

Tesi di Laurea

Facoltà: Farmacia

Autore: Andrea Pierleoni Contatta »

Composta da 90 pagine.

 

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